Baicalein誘導小鼠黑色素瘤細胞株死亡機轉之探討

在之前的研究中我們確定了baicalein會刺激B16F10小鼠黑色素瘤細胞株產生superoxide及hydroxyl radical，且此ROS的產生路徑與12-lipoxygenase (12-LOX)有關。同時也發現baicalein會造成細胞存活率的下降和細胞凋亡；然而baicalein造成細胞死亡到底是因為產生了ROS還是本身抑制12-LOX的關係，原因仍是眾說紛紜。所以本次研究我們利用胞外的ROS清除劑mannitol、catalase及胞內ROS清除劑DMPO、CMH來清除baicalein產生的ROS，結果發現ROS清除劑對於細胞的生長變異影響不大，但在MTT觀察細胞生存率的實驗中可以有效回復baicalein造成的細胞存活率下降，而在研究蛋白表現的western bloting實驗上，ROS清除劑對於細胞凋亡蛋白active caspase-3和內在途徑凋亡蛋白Bax的表現又沒有改變。另外在12-LOX方面，我們使用了12-LOX的下游活性產物 (12-HETE)來抵消baicalein的12-LOX抑制作用，結果發現12-HETE雖然對於細胞生長變異不產生影響，但是可以回復baicalein誘導的B16F10小鼠黑色素瘤細胞存活率下降，其對於baicalein產生的active caspase-3表現增加也有明顯地抑制作用。最終我們也同時給予ROS清除劑和12-HETE共同作用，結果發現兩者同時存在下會將baicalein對小鼠黑色素瘤細胞的傷害降到最低，如此可以說明，baicalein造成的B16F10小鼠黑色素瘤細胞死亡，與ROS產生和抑制12-LOX皆有關係；然而細胞凋亡部分則是因為baicalein抑制了12-LOX所造成。另外我們也用siRNA技術來降低12-LOX的表現，結果發現baicalein造成控制組細胞生存率的下降遠高於12-LOX siRNA的細胞，所以我們推論baicalein造成的細胞死亡必會透過12-LOX，而且12-LOX siRNA與baicalein抑制12-LOX機轉不同，再由之前研究12-LOX siRNA會降低baicalein在B16F10細胞產生的ROS，推論baicalein造成的細胞死亡主因應該是ROS，而此死亡也應為細胞壞死。為了證實以上論點，我們還另外用了流式細胞儀來分析baicalein造成的細胞死亡，結果發現細胞壞死果然是細胞死亡的主要部份，細胞凋亡所佔比率甚小。由以上實驗結果可以推出一個結論，baicalein造成B16F10小鼠黑色素瘤細胞的死亡，主因為其透過12-LOX產生的ROS，所以大部份的死亡是細胞壞死，其中baicalein抑制12-LOX造成之細胞凋亡僅佔細胞死亡的一小部份。