開發高感度miRNA偵測方法及其應用於肝癌檢測

肝癌是台灣常見的惡性腫瘤，由於檢測上的困難，使得病患常到晚期才被診斷出來，導致肝癌的預後差及死亡率高，因此肝癌的檢測方法一直是研究上的重大議題。近年來由於基因體檢測技術上的進步，許多研究試圖檢測基因體上微量的變化，以觀察癌症發生的可能性。由於microRNA (miRNA) 調控許多癌化基因的表現，因此不同群組的miRNA表現量的變化與癌症之間有密切的相關性，若能從特定有意義的miRNA上著手，即可能應用於肝癌早期的診斷。但由於病人的臨床檢體取得不易且數量稀少，所以本研究試圖開發出高感度及時定量聚合酶鏈反應(Real-Time quantitative PCR, RT-qPCR)的方法，以期能降低檢體使用量。基於檢體量減少及專一性目的，首先選用Taqman probe並行多探針(multiplex)的方法，進行RT-qPCR的反應。結果顯示，無論是在反轉錄時將多種miRNA的引子混合，或者是反轉錄時用單一引子，接著進行多種miRNA引子混合的qPCR 方式，都沒有良好的反應訊號，且無法節省檢體使用量。然而，利用了universal反轉錄系統，將檢體之RNA同時反轉錄成cDNA(包含了mRNA即miRNA)，後續改以SYBR Green I來進行qPCR的反應，相較於Taqman probe系統，1000 ng的樣品即可同時偵測四種不同的miRNA，大幅減少檢體的使用量，並呈現穩定良好的反應訊號。進一步降低樣品用量至100 ng時，也可順利偵測出miRNA，且趨勢不變；此外，在不同肝癌細胞株間，稀釋cDNA不會改變miRNA偵測結果的差異。總結上述成果，本研究開發出一高感度miRNA檢測方法，能利用少量的檢體同時有效地偵測出肝癌細胞株多個miRNA表現量。