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醣皮質固醇與興奮性胺基酸促進神經再生之協同作用機轉研究
Other Title
Mechanisms of Glucocorticoid-Excitatory Amino Acid Synergy on Promoting Nerve Regeneration
Type
thesis
Date Issued
2007-01-04
Author(s)
蔡世音
Advisor
李怡萱
Subjects
系所名稱:醫學科學研究所
Description
學位別：博士
語文別：英文
指導教授：李怡萱
共同指導教授：
口試委員：范明基;黃銓珍;王家儀;許重義;李文森;張淑芬
中文關鍵字：醣皮質固醇;興奮性胺基酸;神經再生;神經生長因子;生長相關蛋白43;蛋白激酶C;Janus kinase;signal transducer and activator of transcription 3;Nogo;RhoA
語文別：英文
指導教授：李怡萱
共同指導教授：
口試委員：范明基;黃銓珍;王家儀;許重義;李文森;張淑芬
中文關鍵字：醣皮質固醇;興奮性胺基酸;神經再生;神經生長因子;生長相關蛋白43;蛋白激酶C;Janus kinase;signal transducer and activator of transcription 3;Nogo;RhoA
Abstract
中樞神經系統損傷後，常伴隨壓力性激素醣皮質固醇(glucocorticoids)及興奮性胺基酸麩胺酸(glutamate) 的大量釋放，而造成續發性的神經損傷。然而，臨床上卻發現利用高劑量之合成性醣皮質固醇methylprednisolone (MP)及dexamethasone在治療急性中樞神經系統損傷的病人可產生一定程度之療效。此外，近年亦有報告指出，興奮性胺基酸除了過去所認知的細胞毒性外，可藉由作用在專一性受體進而促成神經細胞之發育及再生。因此，本論文旨在探討醣皮質固醇及興奮性胺基酸對損傷後神經再生的影響及可能之生理及病理作用機轉。
本實驗利用Sprague Dawley (SD)雄性大白鼠背根神經節去軸突(axotomized dorsal root ganglion, AX-DRG)離體培養為實驗系統，投予齧齒類最主要之醣皮質固醇corticosterone (CORT)及麩胺酸受體之促動劑紅藻胺酸(kainic acid, KA)模擬神經損傷之外在環境，來研究其對神經纖維生長的影響。結果發現早期(離體培養之第一天及第二天)依序投予10 ?嵱 CORT及1 mM KA可有效促進神經纖維生長及生長相關蛋白43 (growth-associated protein 43, GAP-43)的表現。若延遲至離體培養之第三天及第四天再投予CORT及KA，非但無法有效增進神經生長，甚至會造成細胞毒性。而此神經滋養作用在阻斷或剔降(knockdown)醣皮質固醇及AMPA/KA受體的活性後便被消除。以上結果顯示，由醣皮質固醇與興奮性胺基酸所模擬的神經損傷環境，在一特定的時間範圍內，會有神經滋養與促進神經再生的作用。
因此，接續之實驗為探討CORT及KA是如何調控GAP-43的表現與活性。結果顯示，CORT及KA所引發的促神經生長作用可被TrkA 激酶之抑制劑AG-879所阻斷。除了在細胞免疫染色上可發現CORT及KA可增加細胞本體及神經纖維上GAP-43及神經生長因子(nerve growth factor, NGF)的表現外，在西方點墨的實驗中亦證實CORT及KA可明顯地增加TrkA及GAP-43的表現量。由於已知GAP-43須經蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC)磷酸化後才有促神經生長作用。而PKC除了可磷酸化GAP-43外，亦可在炎性反應相關之調控因子signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)第727胺基酸序列絲胺酸位置(Ser727)進行磷酸化。但此磷酸作用需在STAT3第705胺基酸序列酪胺酸位置(Tyr705)先被Janus kinase (JAK)磷酸化後方可進行。因此，接下來的實驗我們有興趣瞭解的是PKC在CORT及KA所造成之促神經生長作用中所扮演的角色。在投予CORT及KA之前，分別先加入JAK抑制劑AG-490及PKC抑制劑Ro-318220可顯著降低CORT及KA之促神經生長作用。在反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及免疫染色結果中均證實CORT及KA增加之GAP-43之mRNA及蛋白質的量在抑制JAK及PKC的活性後均明顯降低。此外，CORT及KA可促進GAP-43及STAT3上之磷酸化，而此作用可被PKC抑制劑所消減。在活體脊髓損傷之動物模式中，我們採用MP取代CORT，亦可觀察到不論在脊髓或DRG中MP均可促進GAP-43磷酸化的作用。
由於神經生長除了受神經滋養及生長因子所促進外，亦可能受生長抑制性因子所調控。其中，NogoA為在髓鞘發現之抑制性蛋白之ㄧ，其表現在細胞表面並可與表現在神經元上的專一性受體Nogo-66 receptor (NgR)結合，而引發下游RhoA 及Rho 相關激酶(Rho-associated kinase, ROK)的活化，進而抑制神經纖維的生長。因此，我們同時探討了CORT及KA是否可能藉由調降神經元及神經膠細胞中NogoA的表現及作用而造成促神經生長作用。RT-PCR及免疫染色結果中發現CORT及KA可降低NogoA之mRNA及蛋白質的表現，而此作用在阻斷或剔降GR的活性後可被逆轉。CORT及KA合併投予所造成之促神經生長作用，在利用ROK抑制劑Y-27632取代CORT仍然存在。此外，西方點墨法的實驗中我們亦發現單獨投予CORT即可顯著降低RhoA的表現量。另在星狀膠細胞(astrocyte)之離體培養系統中，亦證實CORT可顯著抑制星狀膠細胞中RhoA的表現量，而投予MP可明顯降低由興奮性毒性所誘發的NogoA表現量。
綜合以上實驗結果，我們發現神經損傷初期投予醣皮質固醇及興奮性胺基酸可協同促進神經纖維之生長。此作用機制可能與CORT透過作用在GR而抑制NogoA及RhoA的表現有關。此現象可協同促進後續由興奮性胺基酸透過AMPA/KA受體所造成之PKC活性相依之促神經生長機制，進而達到神經修復的作用。
本實驗利用Sprague Dawley (SD)雄性大白鼠背根神經節去軸突(axotomized dorsal root ganglion, AX-DRG)離體培養為實驗系統，投予齧齒類最主要之醣皮質固醇corticosterone (CORT)及麩胺酸受體之促動劑紅藻胺酸(kainic acid, KA)模擬神經損傷之外在環境，來研究其對神經纖維生長的影響。結果發現早期(離體培養之第一天及第二天)依序投予10 ?嵱 CORT及1 mM KA可有效促進神經纖維生長及生長相關蛋白43 (growth-associated protein 43, GAP-43)的表現。若延遲至離體培養之第三天及第四天再投予CORT及KA，非但無法有效增進神經生長，甚至會造成細胞毒性。而此神經滋養作用在阻斷或剔降(knockdown)醣皮質固醇及AMPA/KA受體的活性後便被消除。以上結果顯示，由醣皮質固醇與興奮性胺基酸所模擬的神經損傷環境，在一特定的時間範圍內，會有神經滋養與促進神經再生的作用。
因此，接續之實驗為探討CORT及KA是如何調控GAP-43的表現與活性。結果顯示，CORT及KA所引發的促神經生長作用可被TrkA 激酶之抑制劑AG-879所阻斷。除了在細胞免疫染色上可發現CORT及KA可增加細胞本體及神經纖維上GAP-43及神經生長因子(nerve growth factor, NGF)的表現外，在西方點墨的實驗中亦證實CORT及KA可明顯地增加TrkA及GAP-43的表現量。由於已知GAP-43須經蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC)磷酸化後才有促神經生長作用。而PKC除了可磷酸化GAP-43外，亦可在炎性反應相關之調控因子signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)第727胺基酸序列絲胺酸位置(Ser727)進行磷酸化。但此磷酸作用需在STAT3第705胺基酸序列酪胺酸位置(Tyr705)先被Janus kinase (JAK)磷酸化後方可進行。因此，接下來的實驗我們有興趣瞭解的是PKC在CORT及KA所造成之促神經生長作用中所扮演的角色。在投予CORT及KA之前，分別先加入JAK抑制劑AG-490及PKC抑制劑Ro-318220可顯著降低CORT及KA之促神經生長作用。在反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及免疫染色結果中均證實CORT及KA增加之GAP-43之mRNA及蛋白質的量在抑制JAK及PKC的活性後均明顯降低。此外，CORT及KA可促進GAP-43及STAT3上之磷酸化，而此作用可被PKC抑制劑所消減。在活體脊髓損傷之動物模式中，我們採用MP取代CORT，亦可觀察到不論在脊髓或DRG中MP均可促進GAP-43磷酸化的作用。
由於神經生長除了受神經滋養及生長因子所促進外，亦可能受生長抑制性因子所調控。其中，NogoA為在髓鞘發現之抑制性蛋白之ㄧ，其表現在細胞表面並可與表現在神經元上的專一性受體Nogo-66 receptor (NgR)結合，而引發下游RhoA 及Rho 相關激酶(Rho-associated kinase, ROK)的活化，進而抑制神經纖維的生長。因此，我們同時探討了CORT及KA是否可能藉由調降神經元及神經膠細胞中NogoA的表現及作用而造成促神經生長作用。RT-PCR及免疫染色結果中發現CORT及KA可降低NogoA之mRNA及蛋白質的表現，而此作用在阻斷或剔降GR的活性後可被逆轉。CORT及KA合併投予所造成之促神經生長作用，在利用ROK抑制劑Y-27632取代CORT仍然存在。此外，西方點墨法的實驗中我們亦發現單獨投予CORT即可顯著降低RhoA的表現量。另在星狀膠細胞(astrocyte)之離體培養系統中，亦證實CORT可顯著抑制星狀膠細胞中RhoA的表現量，而投予MP可明顯降低由興奮性毒性所誘發的NogoA表現量。
綜合以上實驗結果，我們發現神經損傷初期投予醣皮質固醇及興奮性胺基酸可協同促進神經纖維之生長。此作用機制可能與CORT透過作用在GR而抑制NogoA及RhoA的表現有關。此現象可協同促進後續由興奮性胺基酸透過AMPA/KA受體所造成之PKC活性相依之促神經生長機制，進而達到神經修復的作用。