鎘細胞毒性之分子訊息探討

依據細胞外觀的變化及訊息路徑的差異，細胞計畫性死亡主要可區分為二種死亡模式，分別為apoptosis (type I)及autophagy (type II)，且具有互相調控的特質。重金屬鎘(Cd)為環境污染物，且腎臟為其最終累積器官，並會導致蛋白尿、腎絲球過濾失常及腎結石等病變，然而其分子機制及autophagy於Cd腎毒性所扮演之角色有待進一步釐清。本論文利用腎間質細胞(mesangial cells)為實驗模式探討Cd導致腎細胞死亡之分子機轉，並了解autophagy之角色。實驗結果顯示，以Cd處理腎間質細胞後，利用annexin V/PI double stain及acridine orange進行流式細胞儀定量實驗，發現apoptosis及autophagy之比例隨劑量及時間而增加，而利用Western blot及電子顯微鏡技術，可明顯觀察到LC-3 II蛋白質量上升及autophagosome的累積，且autophagy及caspase抑制劑皆可增加其細胞存活率，証實Cd可誘使mesangial cells產生混合型的細胞死亡模式，包括autophagy及apoptosis。且mesangial cells經由預先處理GSK-3?狶磻蹌?(SB 216763)及siRNA可有效的抑制Cd所誘使的autophagy，而過度表現GSK-3?珓h明顯增加Cd導致的autophagy，故推測GSK-3?珙蚓d導致autophagy之訊息分子之一。以DCFH-DA染色法偵測細胞中的H2O2濃度，可明顯觀察到細胞內氧化壓力上昇，且ROS scavenger (N-acetylcysteine, NAC)則有效的降低細胞中的H2O2並且抑制Cd誘導的autophagy。且由Western blot實驗亦顯示，NAC亦可有效的抑制Cd所導致的GSK-3?猁漪﹞①C綜合以上所見，推測Cd可導致混合型的細胞死亡模式，且ROS-GSK-3?珧T息路徑於autophagy的過程中，扮演了重要的調控角色。除此之外，以Fluo3-AM分析胞內鈣離子濃度，結果顯示細胞內鈣離子顯著上升，且鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)可有效的降低Cd所導致的autophagy及apoptosis，而阻斷內質網的鈣離子通道(IP3R)，可降低Cd誘使的鈣離子濃度上昇及細胞死亡。Calcineurin已被証實可經由去磷酸化IP3R，進而降低內質網釋放鈣離子速度，故mesangial cells經由轉染calcineurin siRNA，可明顯增加細胞內鈣離子濃度及細胞死亡比例，因此Cd可經由釋放內質網的鈣離子，進而促使細胞死亡。另一方面，細胞經由預處理MEK 1/2抑制劑(PD 98059及U0126)，可降低Cd所導致的autophagy，且利用Western blot技術觀察到BAPTA-AM可降低ERK的活化，故推測Ca2+-ERK訊息傳遞於Cd誘導的autophagy過程中扮演重要角色。粒線體已被証實參與了細胞死亡的調控，而於本研究中，可觀察到粒線體的去極化現象，且BAPTA-AM及2-APB (IP3R抑制劑)可降低粒線體的去極化及caspase-dependent apoptosis。最後，以NAC預處理的細胞，其ERK磷酸化、鈣離子濃度及apoptosis的比例皆明顯下降，顯示ROS的上升是導致Cd毒性的根本原因。因此Cd可導致細胞產生複合式的細胞死亡，包括autophagy及apoptosis，且推測細胞內ROS及鈣離子濃度的變化是最主要的原因，並經由GSK-3?牷BERK或粒線體路徑導致autophagy或apoptosis。