牛痘病毒膜融合蛋白複合體之結構與功能性分析

痘病毒是一類在全世界廣泛分布的大型DNA病毒，能在不同物種中引發多種疾病。這些病毒擁有廣泛的宿主範圍，從人類到諸多脊椎動物、節肢動物，乃至於真核單細胞生物，都有其宿主存在。其中，對人類影響重大的著名例子包括天花病毒、牛痘病毒和猴痘病毒等。痘病毒與大多數病毒的不同之處在於，它不是利用一或兩種膜融合蛋白質來進行對宿主細胞的附著及膜融合，而是利用一種稱為膜融合複合體（Entry Fusion Complex, EFC）的大型多蛋白質複合物來進行對宿主細胞的膜融合過程。EFC由11個蛋白質組成（A16、A21、A28、G3、L5、G9、H2、I2、J5、L1、F9和O3），並與四種病毒附著蛋白質（H3、D8、A26、A27）協同作用，完成入侵宿主細胞的機制。值得注意的是，在EFC的蛋白質中，有三組蛋白質（A28-H2、A16-G9、L5-G3）在沒有其他EFC成員存在的情況下，也可以形成穩定的異二聚體。目前對於痘病毒如何利用EFC進行膜融合的過程仍不清楚，其組成配置及機制尚待進一步了解。為了能夠了解由EFC所調控的膜融合機制，我們的目標是利用結構生物學的研究方法來解析EFC各個蛋白質的結構，以期了解每個蛋白質的結構及功能。在本論文中，我們利用高準確度蛋白質結構預測AI模型：Alphafold2，對EFC各個蛋白質進行結構預測，並基於預測出的結構，建立了一套系統性的重組蛋白質表達、純化及結晶系統。我們進一步利用X射線晶體學的方法解析蛋白質之結構，最終獲得了兩個EFC蛋白質 G9和H2之晶體結構。在隨後的結構分析中，我們比較了我們的G9二聚體晶結構與幾乎同時發表的A16-G9二聚體結構，建構出一個A16-G9結合模型。我們觀察到G9的一段具結構之彈性的環區域（Flexible loop）8-ELPKRDPPPGVPT-20與A16產生交互作用，並發現其中重要的分子間作用力。在對我們的H2晶體結構進行結構及功能分析後，我們揭示了H2蛋白質的關鍵界面，特別是兩個環區域170-LGYSG-174和124-RRGTGDAW-132的重要性，並發現定點突變（Mutagenesis）這些區域的氨基酸會對病毒活性產生顯著影響。另一方面，由我們的合作者主導的研究也在同一時間成功解析出蛋白質A28之核磁共振光譜（Nuclear magnetic resonance，NMR）結構。通過對H2及A28之結構分析與嵌合試驗，我們成功建構出了H2和A28蛋白質之間的交互作用模型。值得注意的是，H2和A28的嵌合試驗結果分析揭示了H2利用其關鍵的環區域124-RRGTGDAW-132與A28的53-FEYSKSIGGTPA-64進行結合，與A16-G9中觀察到的情況類似。總結來說，本研究為我們理解EFC的結構及作用機制提供了進一步的資訊，並加深了我們對痘病毒入侵宿主細胞機制的理解。