於痰液及血漿樣本中檢測遺傳和表遺傳生物分子指標做為肺癌早期診斷依據的探討

研究緣起：肺癌是國人癌症致死率的首位，也是全世界最普遍的惡性腫瘤之一，全世界每年有超過百萬人死於肺癌，據統計罹患肺癌後五年的存活機率約10~15%，依據患者手術當時的癌症分期而定，愈晚期治療，存活率愈低。傳統上針對長期抽煙的人採用胸部X光照影以及痰液細胞學檢驗來進行篩選的策略，已經證實無法有效早期偵測肺癌來降低肺癌的致死率。因此利用靈敏性較高的分子指標進行早期偵測是目前刻不容緩，也是提高肺癌患者存活率的重要工作。 研究目的：癌細胞的轉變是一連串分子變異累積形成的，這些變異發生在抑癌基因 (Tumor suppressor gene, TSG)、致癌基因 (Oncogene)、DNA修補基因，以及內在或外在環境因子造成的基因不穩定現象。已有少數研究顯示在肺癌病人痰液、氣管灌流液以及血清樣本中，可以偵測出癌症相關基因啟動子高度甲基化、基因座缺失及微衛星序列重複次數改變所得之基因體不穩定現象。本研究主要目的在於更進一步確認可在肺癌患者的痰液(sputum) 及血漿(plasma)樣本中偵測到與肺癌組織一致的分子變異指標，進一步挑選出多個靈敏性與專一性較高的分子指標作為未來早期肺癌相關分子指標群 (Early detection biomarkers)。 研究方法：Part I，在83位肺癌病人的肺癌細胞及痰液 (sputum) 樣本中，利用methylation-specific PCR (MSP) 共檢查了三個基因 (FHIT, p16INK4a, and RARβ) 的啟動子高度甲基化 (promoter hypermethylation)，並且偵測了八個微衛星序列 (D3S1234, D3S1285, D5S1456, D9S286, D9S942, GATA49D12, D13S170, and D17S786) 的異質性缺失 (loss of heterozygosity, LOH) 及微衛星不穩定現象(microsatellite instability, MSI)。Part II，63位肺癌病人的肺癌組織及血漿 (plasma) 樣本中，利用MSP共檢查了六個基因 (BLU, CDH13, FHIT, p16INK4a, RARβ, and RASSF1A) 的啟動子高度甲基化，並利用比色分析肺癌病人的血漿樣本之DNA總濃度。另外還有36位無肺癌個體的痰液及血漿樣本的偵測，分別作為肺癌病人的痰液及血漿分析的對照組。 研究結果：Part I痰液分析，本研究於肺癌細胞及痰液的分子指標偵測結果分別進行靈敏性 (sensitivity)、專一性 (specificity)、一致性 (concordance) 及危險比 (odds ratio, OR) 的分析，挑選出的合適指標包括D9S286、D9S942、GATA49D12、D13S170的 LOH，D9S942 MSI，以及p16INK4a、RARβ的甲基化分析共七個變異；其中，痰液樣本中發生D9S942 LOH的危險比為5.6 (95% confidence interval, CI: 1.78~19.46, P=0.003)，p16INK4a甲基化的危險比為4.15 (95% CI: 1.46~15.02, P=0.006)。七個合適指標偵測結果採取聯集判定，其預測的靈敏度為80%，專一性有72%，一致性為77%，未來將以此方式應用於早期肺癌的臨床檢驗。 Part II血漿分析，甲基化頻率較高的指標有p16INK4a、RARβ及RASSF1A，且血漿中p16INK4a甲基化的危險比為6.18 (95%CI: 1.89~28.0, P=0.002)，RASSF1A甲基化的危險比為6.02 (95%CI: 1.82~27.52, P=0.002)。以p16INK4a、RARβ以及RASSF1A三基因任一個甲基化的聯集判定，預測效果的靈敏度為74%，專一性有78%，一致性為75%。利用training set (43位肺癌病人，22位無肺癌個體) 的偵測結果進行迴歸分析，再以test set (20位肺癌病人14位無肺癌個體) 進行驗證，得到82%的符合率，最後以所有樣本 (63位肺癌病人，36位無肺癌個體) 的偵測結果計算得到的新迴歸方程式如下Y = -0.35＋0.30 (BLU methyl)＋1.84 (p16INK4a methyl)＋1.70 (RASSF1A methyl)，預測的靈敏性有77%，專一性為90%，一致性有79%，未來將以此方式應用於早期肺癌的臨床檢驗。在血漿游離DNA總濃度測定方面，肺癌病人血漿DNA總濃度的中位數是63.47ng/μl，無癌症個體的血漿DNA總濃度的中位數是38.50 ng/μl，肺癌病人血漿DNA總濃度高於無癌症個體的血漿DNA總濃度 (P<0.0001)。且血漿DNA總濃度大於cut-off值 (50ng/μl)而罹患肺癌的危險比 3.42 (95% CI＝1.47~8.25, P=0.004)。 結論：分析結果所挑選出來的肺癌相關分子指標群，如：痰液中的七個微衛星和甲基化指標群、血漿中的DNA總濃度，未來將應用於臨床大量篩檢，檢查結果為異常的個案將持續追蹤，期待能夠早期發現，早期治療，降低國人的肺癌致死機率。