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人類單核球細胞產生腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酵素之調控機轉
Other Title
The regulatory mechanisms of the production of tumor necrosis factor-α and matrix metalloproteinase in human monocytic cells
Type
thesis
Date Issued
2011-07-04
Author(s)
周泳臣
Advisor
蕭哲志
Subjects
系所名稱：醫學科學研究所
Description
學位別：博士
語文別：英文
指導教授：蕭哲志
共同指導教授：
口試委員：林琬琬;吳錦楨;顏茂雄;許準榕;施純明;陳彥州
中文關鍵字：腫瘤壞死因子;單核球;高張;內吞作用;轉錄後調控;第九型基質金屬蛋白酵素
語文別：英文
指導教授：蕭哲志
共同指導教授：
口試委員：林琬琬;吳錦楨;顏茂雄;許準榕;施純明;陳彥州
中文關鍵字：腫瘤壞死因子;單核球;高張;內吞作用;轉錄後調控;第九型基質金屬蛋白酵素
Abstract
腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種發炎前(proinflammatory)細胞激素，在急性骨髓性白血病以及敗血症中它都扮演非常重要的角色。其在體內主要是由巨嗜細胞以及單核球細胞來製造與釋放，尤其是受內毒素(endotoxin)刺激時更加明顯。TNF-α蛋白在細胞中合成出來後會鑲在細胞膜上，其可以被TNF-α converting enzyme (TACE)酵素切下而釋放到細胞外。在過去文獻中發現高張壓力於活化的單核球細胞中會加強TNF-α的表現，但真正的機轉目前仍未被探討。已知細胞表面的TNF-α以及TACE蛋白在細胞活化時皆會進行內吞作用(endocytosis)而減少表現，恰巧高張環境也會干擾endocytosis的進行，因此本研究便進行一連串的實驗來探討高張環境加強TNF-α釋放可能涵蓋的機制。
TNF-α被釋放後可以引發許多發炎反應，並刺激基質分解酵素的產生。在許多病理過程中經常可以發現細胞外基質不正常的重塑作用(remodeling)，而這些基質的破壞主要是由基質金屬水解酶(MMPs)完成。本實驗發現，在接受LPS或PMA刺激的THP-1細胞中，蔗糖或NaCl所形成的高張環境皆可以顯著地加強其TNF-α的釋放。本研究也發現同樣皆具有內吞抑制作用的各種成分(包含高張蔗糖溶液)皆能增加PMA刺激時細胞膜上TACE的表現，但它們對活化細胞中的TNF-α釋放作用卻不一致。這樣的TNF-α釋放加強作用無法被TACE或IκB kinase抑制劑所抑制，但可以被蛋白合成抑制劑(cycloheximide)及MAP/ERK kinase抑制劑所阻斷。有趣的是TNF-α的mRNA表現不論是用LPS或PMA刺激，在高張環境下反而會明顯降低。而在LPS刺激下，THP-1細胞內的ERK1/2蛋白會在高張環境中重新再次磷酸化，而這樣的ERK活化對於TNF-α的加強釋放作用是必要的。
TNF-α所引發的基質金屬水解酶也參與了發炎和癌細胞侵襲轉移的過程。實驗中發現N-hydroxy cinnamoyl phenalkyl amides的類似物N-2-(4-bromophenyl) ethyl caffeamide (EK5) 在THP-1細胞中可以有效抑制TNF-α所引發的MMP-9蛋白表現。而不僅是MMP-9蛋白，其mRNA也同樣會被EK5依濃度梯度所抑制。NF-κB已知是一種製造MMP-9所需要的轉錄因子，其可以被各種發炎前細胞激素所活化並促進發炎反應。藉由轉染實驗送入的NF-κB報導基因，本研究發現EK5可以明顯壓制NF-κB的訊息傳遞，不過EK5對於NF-κB訊息傳遞上游的IκBα的降解以及NF-κB本身的轉位(translocation)卻沒有影響。有趣的是透過染色體免疫沉澱法(chromatin immunoprecipitation)，得知細胞內的p65蛋白和MMP-9的啟動子基因序列之間的結合會被EK5完全阻斷，不過p65上的磷酸化並不受藥物所影響。
總合結論，在LPS或PMA所活化的THP-1細胞中，高張環境所加強的TNF-α釋放需要ERK的活化，而且可能不需經由TACE的切除作用。而本研究所發現的這種轉錄後(post-transcriptional)調控方式可以引發已活化的血癌細胞製造出“巨量”的TNF-α，對於臨床上惡病質現象多了一個可深入探討的治療途徑。本研究也證明了EK5具有一個嶄新的分子機轉活性，其在人類單核球細胞中會阻斷核內NF-κB的訊息而抑制TNF-α所引發的MMP-9蛋白產生，至於其抗發炎的詳細機制仍需要更多的研究及動物實驗加以證實。
TNF-α被釋放後可以引發許多發炎反應，並刺激基質分解酵素的產生。在許多病理過程中經常可以發現細胞外基質不正常的重塑作用(remodeling)，而這些基質的破壞主要是由基質金屬水解酶(MMPs)完成。本實驗發現，在接受LPS或PMA刺激的THP-1細胞中，蔗糖或NaCl所形成的高張環境皆可以顯著地加強其TNF-α的釋放。本研究也發現同樣皆具有內吞抑制作用的各種成分(包含高張蔗糖溶液)皆能增加PMA刺激時細胞膜上TACE的表現，但它們對活化細胞中的TNF-α釋放作用卻不一致。這樣的TNF-α釋放加強作用無法被TACE或IκB kinase抑制劑所抑制，但可以被蛋白合成抑制劑(cycloheximide)及MAP/ERK kinase抑制劑所阻斷。有趣的是TNF-α的mRNA表現不論是用LPS或PMA刺激，在高張環境下反而會明顯降低。而在LPS刺激下，THP-1細胞內的ERK1/2蛋白會在高張環境中重新再次磷酸化，而這樣的ERK活化對於TNF-α的加強釋放作用是必要的。
TNF-α所引發的基質金屬水解酶也參與了發炎和癌細胞侵襲轉移的過程。實驗中發現N-hydroxy cinnamoyl phenalkyl amides的類似物N-2-(4-bromophenyl) ethyl caffeamide (EK5) 在THP-1細胞中可以有效抑制TNF-α所引發的MMP-9蛋白表現。而不僅是MMP-9蛋白，其mRNA也同樣會被EK5依濃度梯度所抑制。NF-κB已知是一種製造MMP-9所需要的轉錄因子，其可以被各種發炎前細胞激素所活化並促進發炎反應。藉由轉染實驗送入的NF-κB報導基因，本研究發現EK5可以明顯壓制NF-κB的訊息傳遞，不過EK5對於NF-κB訊息傳遞上游的IκBα的降解以及NF-κB本身的轉位(translocation)卻沒有影響。有趣的是透過染色體免疫沉澱法(chromatin immunoprecipitation)，得知細胞內的p65蛋白和MMP-9的啟動子基因序列之間的結合會被EK5完全阻斷，不過p65上的磷酸化並不受藥物所影響。
總合結論，在LPS或PMA所活化的THP-1細胞中，高張環境所加強的TNF-α釋放需要ERK的活化，而且可能不需經由TACE的切除作用。而本研究所發現的這種轉錄後(post-transcriptional)調控方式可以引發已活化的血癌細胞製造出“巨量”的TNF-α，對於臨床上惡病質現象多了一個可深入探討的治療途徑。本研究也證明了EK5具有一個嶄新的分子機轉活性，其在人類單核球細胞中會阻斷核內NF-κB的訊息而抑制TNF-α所引發的MMP-9蛋白產生，至於其抗發炎的詳細機制仍需要更多的研究及動物實驗加以證實。