探討CWH43在大腸直腸癌進展與化療抗藥性中的調控機制

大腸直腸癌（colorectal cancer, CRC，又稱大腸癌）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發生率與死亡率長期居高，對公共健康構成重大威脅。在臨床上針對晚期或轉移性大腸直腸癌病患，經常使用5-fluorouracil（5-FU）及irinotecan（CPT-11）作為化學治療藥物，部分病人因為腫瘤異質性的因素致使治療效果不佳，產生藥物抵抗性的狀況，如何克服這個狀況，仍是臨床上重要的課題。CWH43（Cell Wall Biogenesis 43）是一種參與細胞膜結構調控的蛋白質，其主要功能為修飾細胞膜上的glycosylphosphatidylinositol（GPI）-錨定蛋白的脂質結構，協助GPI結合蛋白質能定位於細胞膜外側，進行其相關的功能，例如：細胞訊號傳遞與黏附能力。先前研究指出CWH43為在大腸直腸癌癌中表現顯著下降，並可能具有腫瘤抑制功能。然而，CWH43在大腸直腸癌的進行及治療上的角色仍不清楚，本研究針對CWH43在大腸直腸癌進展及藥物反應上的角色作探討。首先在生物資訊分析發現CWH43在大腸直腸癌組織中的表現量比正常組織低，而且低表達CWH43病人的總體存活期（OS）較短。在細胞研究結果中，發現抑制CWH43表達可導致大腸直腸癌細胞的增殖能力、遷移及侵襲能力增加。利用動物模組實驗發現，腫瘤生成速度在抑制CWH43的狀況下明顯較控制組快。大量表現CWH43在腫瘤細胞上會導致細胞增殖、遷移及侵襲能力降低。利用西方點墨法偵測上皮-間質轉換（EMT）相關標誌蛋白質發現，降低CWH43表現量會導致β-catenin、Vimentin及N-cadherin表現量上升，並促使E-cadherin表現量降低。這些結果與抑制CWH43促進轉移及遷襲能力的結果一致。為探討CWH43的下游調控機制，本研究分別在CWH43過度表達與抑制表達的大腸癌細胞中進行RNA定序，鑑別出兩組差異表達基因。進一步分別將這兩組差異表達基因進行蛋白質互動網絡（PPI）分析，篩選出各自的潛在核心調控基因。接著，分別對這兩組核心基因進行KEGG富集分析，結果顯示cell cycle為CWH43可能參與的關鍵下游訊號通路。聚焦分析細胞週期相關基因後，發現TTK（Thr/Tyr kinase）在抑制CWH43表現時會顯著上升，反之而於大量表現CWH43時則會明顯下降。qPCR實驗進一步印證CWH43可負向調控TTK表現。使用TTK抑制劑AZ3146處理CWH43被抑制的細胞，能有效降低其促進的細胞增殖與遷移能力。這些結果證明CWH43可藉由負向調控TTK的表現來調控細胞增殖及遷移能力。我們進一步探討CWH43在化學治療的角色，首先從臨床資料分析，發現化療反應不佳病人的CWH43表現量相對較高，另外在晚期大腸直腸癌病人中發現CWH43高表現的病人的疾病特異性生存期（DSS）較短。為探討CWH43在化療反應中的功能角色，我們透過CCK-8細胞活性分析與Annexin V/PI細胞凋亡實驗，發現大量表現CWH43會降低大腸直腸癌細胞對5-FU與CPT-11的細胞毒性與凋亡反應，顯示CWH43的表現量可能與藥物敏感性有關。進一步我們用大量表現CWH43細胞的RNA定序結果進行GSEA分析，結果顯示CWH43與NRF2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2）訊號通路高度正相關。qPCR實驗進一步印證CWH43可正向調控NRF2表現。接著我們於大量表現CWH43細胞給予NRF2抑制劑ML385或在CWH43被抑制的細胞給予NRF2活化劑Bardoxolone-methyl作用後，觀察SLC7A11表現的變化，發現CWH43能透過調控NRF2表達，進一步影響其下游目標基因SLC7A11的表現，支持CWH43-NRF2-SLC7A11軸在大腸癌細胞抗氧化調控中的可能角色。接下來，我們利用NC-3000細胞影像分析系統測量細胞內活性氧（ROS）與超氧化物（superoxide）水平，發現CWH43可藉由調控NRF2-SLC7A11軸來降低細胞內氧化壓力。進一步利用shRNA來抑制SLC7A11後，發現抑制SLC7A11可顯著逆轉大量表現CWH43造成的5-FU抗藥性。進一步利用鐵凋亡（ferroptosis）誘導劑Erastin處理CWH43大量表現的細胞，可增加細胞對5-FU的敏感性，進一步證明大量表現CWH43會透過活化NRF2-SLC7A11訊息路徑活化抗氧化防禦機制，降低細胞對氧化壓力的敏感性，並透過抑制鐵凋亡增強化療抗藥性。本研究結果顯示在大腸直腸癌進行上，CWH43會透過TTK來調控腫瘤生長、轉移及EMT影響腫瘤發展。在藥物的反應上，則會透過NRF2-SLC7A11訊號路徑活化提高腫瘤細胞的抗氧化能力，進而抑制鐵凋亡的路徑，導致對化療藥物的抗藥性。本論文研究成果顯示CWH43在大腸直腸癌上扮演重要的角色，除了可以做為預後標的外，也可以當作治療的標的，未來可藉由篩選或開發 CWH43 抑制劑，應用於大腸直腸癌治療中以提升治療成效。