活化PERK及JNK參與Evodiamine抗腫瘤的作用

細胞凋亡是由生理或病理性因素所引起的一種細胞程序性死亡。吳茱萸鹼 (Evodiamine，EVO)來自傳統草藥吳茱萸(Evodia rutaecarpa)的活性抽取物；它屬於喹唑?生物鹼，具有各種藥理活性，如抑制腫瘤生長和抗發炎等。吳茱萸鹼雖然在很多癌症被探討過，但對於腎細胞癌(RCC)和膠質母細胞瘤(glioblastoma) 的抗癌活性及作用尚不清楚需要進一步的研究。在本研究中，使用腎細胞癌(RCC)細胞株A498及神經膠質瘤細胞株U87和C6進行體內及體外實驗。體外實驗結果顯示，我們觀察到A498及U87和C6細胞，加入EVO後，可觀察到與劑量與細胞死亡具有正相關性。 A498及U87和C6細胞，加入EVO後，在顯微鏡下可以觀察到凋亡小體；利用瓊膠電泳以及蛋白質電泳可以觀察到細胞凋亡的特徵，包括DNA 小片段的斷片、半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)蛋白的裂解；利用流式細胞儀將細胞核以染劑染色可以觀察到亞二倍體細胞(hypodiploid)現象發生。SP600125 (SP)是c-Jun氨基末端激酶 (JNK)抑制劑，用來阻斷JNK的信息傳遞；結果顯示，加入SP能顯著降低EVO誘導的細胞凋亡；EVO將透過增加c-Jun N末端激酶 (JNK) 蛋白的磷酸化參與了EVO誘導的細胞死亡。實驗中亦發現，細胞中加入EVO後，粒線體的膜電位(MMP)改變且釋放細胞色素C (cytochrome C)。但若加入半胱氨酸蛋白酶-9抑制劑(Ac-YVAD-FMK)則顯著抑制EVO引起的細胞凋亡，此結果亦顯示EVO誘導內在途徑的細胞凋亡。此外亦觀察到細胞微管蛋白的聚合增加，顯示EVO誘導細胞產生細胞週期G2/M停滯。在EVO處理的膠質瘤細胞中檢測到細胞週期蛋白B1、p53和磷酸化 (p)-p53蛋白表現增加，但加入JNK抑制劑則受到抑制。以裸鼠為動物模式進行體內實驗，將A498 細胞以及U87細胞透過皮下注射引起腫瘤生長後，投與EVO；利用組織免疫染色，觀察腫瘤組織切片，結果顯示，EVO處理後顯示腫瘤中細胞週期蛋白B1，p53的表現而磷酸化p53 (p-p53)蛋白表現增加與細胞實驗相同；另外也觀察到，透過細胞凋亡的內在路徑或是癌細胞內部微環境所產生之內質網壓力，導致內質網應激蛋白 (PERK) 的磷酸化也會因投與EVO顯著增加；當加入內質網應激蛋白抑制劑(GSK2606414)則抑制EVO引起的細胞凋亡。在EVO相關衍生物的分析中，實驗結果顯示，EVO結構中C14位的烷基對細胞凋亡和G2/M停滯的作用具有高度相關性。總體而言，細胞實驗及動物實驗結果顯示，EVO透過活化JNK訊息傳遞、內質網應激蛋白而誘導B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)蛋白磷酸化，導致了MMP的破壞使細胞走向凋亡；預期EVO對膠質母細胞瘤及腎細胞癌具有抗腫瘤潛力，值得進一步研究。