納豆菌 Bacillus subtilis var. natto No. SYH-MT 0379發酵產物在提高 TRAIL 誘發人類大腸癌細胞自殺凋亡效果之研究

納豆菌 (Bacillus subtilis var. natto, 本文簡稱 BS) 被美國 FDA 認為是安全的菌種 (GRAS: Generally recognized as safe) 。 過去研究指出在納豆菌的發酵產物中，有許多具調節人體生理機能功效的代謝物。從先前的實驗結果得知，本實驗室自傳統發酵食品中所分離的納豆菌BS No.SYH-MT 0379 ，經與發芽糙米組合所生產的發酵物，具有抗人類大腸癌的效果。本研究目的在探討 BS No.SYH-MT 0379 與豆蛋白的組合發酵物中，是否存在具抗癌活性新型態之天然物。實驗中同時選用我們過去自嬰幼兒糞便中所分離的地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis, 本文簡稱BL) BL No.TMI-H 1221，做為標的天然物發酵生產的對照菌株，以比較兩者與豆蛋白組合發酵產物的生物活性優劣表現。
實驗結果顯示，BS No.SYH-MT 0379 無論在抗菌、抗脂質過氧化、DPPH自由基清除，以及受含SH基團 (sulfhydryl group) 化合物如：穀胱肽 (glutathione, GSH) 以及以乙醯半胱胺酸 (N-acetylcysteine, NAC) 等拮抗的活性表現，皆較 BL No.TMI-H1221為佳。針對上述活性表現的主要區分，我們利用乙酸乙酯 (ethyl acetate，EtOAc) 酸鹼萃取分層，回收 BS No.SYH-MT 0379 發酵產物，可得到強酸性層萃取物 (AF-01)。AF-01 經矽膠薄層層析 (TLC) 進一步分離，可在 TLC 溶劑展開阻滯值 (retention factor; Rf) 0.5 處，於 UV254 及 365 波長下觀測到一呈現明顯吸收之活性物質，命名為 BS-SBP-1115。此物質所呈現的抗菌活性可因 GSH 以及 NAC 的拮抗而消除。此現象與過去文獻報導具增強TRAIL誘導癌細胞自殺凋亡的天然物，如:zerumbone、celastrol、gossypol等，具有類似的化學反應性。因此，我們接著將AF-01針對人類大腸癌細胞HT-29進行細胞毒性的MTT試驗 (MTT assay)，以及細胞存活率的克隆試驗 (clonogenic assay)，並針對其增強TRAIL誘導大腸癌細胞自殺凋亡的能力進行評估。結果顯示，AF-01 可以大幅增強 TRAIL 所誘導 HT-29 細胞的自殺凋亡，其效果屬於致敏作用 (sensitization)。從西方點墨法分析細胞凋亡相關蛋白表現的結果顯示，活化型 caspase-3 及活化型 caspase-8 等蛋白的表現量隨著藥劑濃度的提高皆有明顯提升。此外，當 AF-01 和 TRAIL 藥劑同時作用時，亦會促使 HT-29 細胞內的 ROS 表現量大幅增加，可推論其亦介入癌細胞的自殺凋亡。本研究結果顯示，納豆菌 BS SYH-MT 0379 的有機萃取物 AF-01，為開發臨床 TRAIL 抗大腸癌致敏劑有潛力的來源。