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尼古丁受體對於人類女性乳房上皮細胞之致癌機制探討
Other Title
Studies on the Roles of Nicotinic Receptor During
Tumorigenesis in Human Female Breast Epithelial Cells
Tumorigenesis in Human Female Breast Epithelial Cells
Type
thesis
Date Issued
2010-12-16
Author(s)
李嘉華
Advisor
何元順
Subjects
系所名稱：醫學科學研究所
Description
學位別：博士
語文別：英文
指導教授：何元順
共同指導教授：吳志雄
口試委員：林仁混;李宣佑;王朝鐘;潘敏雄;王應然
中文關鍵字：尼古丁受體;吸菸;乳癌;雌激素受體;雌激素
語文別：英文
指導教授：何元順
共同指導教授：吳志雄
口試委員：林仁混;李宣佑;王朝鐘;潘敏雄;王應然
中文關鍵字：尼古丁受體;吸菸;乳癌;雌激素受體;雌激素
Abstract
先前有許多大型的流行病學研究指出吸菸以及二手煙的危害和乳癌的發生率有直接的關連性，然而在細胞分子上的研究至今卻沒有直接的證據指出香菸中的致癌物可誘發乳癌的發生。
在本研究中，我們利用反轉錄及聚合酶鏈鎖反應(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)偵測五十例臨床病人乳癌細胞中的各式尼古丁受體(Nicotine Acetylcholine Receptor，nAChR)的表現與否，接著再利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)及雷射擷取細胞技術(Laser Capture Micro-dissection，LCM)來定量276位病人中乳癌和正常乳房細胞中第九型尼古丁受體(alpha 9-nAChR)的表現。在細胞研究方面，我們利用小干擾RNA(siRNA)來培養出持續性第九型尼古丁受體抑制的MDA-MB-231乳癌細胞株。另外我們在MCF-10A正常乳腺細胞的培養液中添加四環黴素來達到腺病毒調控(Tetracyclin inducible adenovirus，Tet-off)第九型尼古丁受體的大量表現與否。最後再利用細胞生長速率(Cell Proliferation Assay)、細胞非貼附性生長(Soft agar assay)及小鼠上腫瘤生長(Tumor Growth)速率來觀察乳房細胞癌化的情況。
結果顯示，276位乳癌病人中有186位病人其第九型尼古丁受體在乳癌細胞的表現遠大於周邊正常乳房細胞的表現，總體來說大約有7.84倍的差距。持續性第九型尼古丁受體抑制的MDA-MB-231乳癌細胞株則明顯在細胞生長速率及細胞非貼附性生長的實驗中明顯受到抑制，將這些乳癌細胞株移植到小鼠(SCID mice)體內後我們也觀察到腫瘤的生長在抑制九型尼古丁受體後其乳癌腫瘤受到明顯的抑制 (每組五隻小鼠; 六周後Si alpha 9 cells的腫瘤大小 = 995.6 mm3, parental cells 的腫瘤大小 = 2993.2 mm3，差距 = 1997.6 mm3, 95% 信賴區間 = 1705 to 2290.2 mm3，P = .009)。 另外在MCF-10A正常乳腺細胞中長期添加尼古丁(Nicotine)及其活性物質4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone (NNK)可發現誘發乳房細胞癌化的現象發生。將這些癌化後的乳房細胞移植到小鼠體內後可觀察到大量表現第九型尼古丁受體的乳癌細胞其腫瘤生長速率會大量增長(每組五隻小鼠; 添加DOX組與是否添加尼古丁= 266.2 mm3 vs 501.6 mm3，差距= 235.4 mm3，95% 信賴區間 = 112.7 to 358 mm3，P = .009; 不添加DOX組與是否添加尼古丁= 621.2 mm3 vs 898.6 mm3，差距= 277.4 mm3，95% 信賴區間 = 98.1 to 456.7 mm3;P = .016; 添加尼古丁組與是否添加DOX = 501.6 mm3 vs 898.6 mm3，差距= 397 mm3，95% 信賴區間 = 241.3 to 552.6 mm3，P = .009)。
另外我們也嘗試找出第九型尼古丁受體(alpha 9-nAChR)表現受到雌激素(17 beta-estradiol，E2)所調控雌激素受體(Estrogen recepto，ER)的上下游表現關係。我們利用上述所提及的即時聚合酶鏈鎖反應及雷射擷取細胞技術來定量339位病人中乳癌和正常乳房細胞中第九型尼古丁受體的表現與雌激素受體表現與否的相關性。利用染色質免疫沉澱(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)的實驗我們發現雌激素受體會調節第九型尼古丁受體的轉錄藉以提高蛋白的生成。
我們觀察到乳癌細胞大量表現第九型尼古丁受體的病人(乳癌細胞比周邊乳房細胞達到十倍以上的差距)其五年術後存活率(5-year disease-specific survival rate)為最差的表現(約百分之五十，病人死亡/存活比值為4/4，共8位病人，P = 0.006)，而乳癌細胞微量表現第九型尼古丁受體的病人(乳癌細胞比周邊乳房細胞小於一倍的差距)則具有最好的五年術後存活率(約百分之八十八，病人死亡/存活比值為3/22，共25位病人，P = 0.006)。另外我們也發現乳癌細胞大量表現第九型尼古丁受體的病人也同時再乳癌細胞上也具有雌激素受體的表現(雌激素受體陽性比雌激素受體陰性，數量為160:72人，第九型尼古丁受體表現為11 ± 3比6.7 ± 2.3 倍)。
雌激素受體是一個十分著名的轉錄因子，因此我們也發現在MCF-7乳癌細胞中雌激素受體會結合到第九型尼古丁受體的啟動子位置(Promoter)上藉以調控尼古丁及雌激素所刺激的第九型尼古丁受體表現。總體而言，我們的研究發現尼古丁及雌激素活化雌激素受體且在調節第九型尼古丁受體的表現上扮演著重要的角色。 總體而言，我們發現第九型尼古丁受體在尼古丁以及雌激素調控乳房細胞癌化的細胞轉型中扮演著重要的角色。
在本研究中，我們利用反轉錄及聚合酶鏈鎖反應(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)偵測五十例臨床病人乳癌細胞中的各式尼古丁受體(Nicotine Acetylcholine Receptor，nAChR)的表現與否，接著再利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)及雷射擷取細胞技術(Laser Capture Micro-dissection，LCM)來定量276位病人中乳癌和正常乳房細胞中第九型尼古丁受體(alpha 9-nAChR)的表現。在細胞研究方面，我們利用小干擾RNA(siRNA)來培養出持續性第九型尼古丁受體抑制的MDA-MB-231乳癌細胞株。另外我們在MCF-10A正常乳腺細胞的培養液中添加四環黴素來達到腺病毒調控(Tetracyclin inducible adenovirus，Tet-off)第九型尼古丁受體的大量表現與否。最後再利用細胞生長速率(Cell Proliferation Assay)、細胞非貼附性生長(Soft agar assay)及小鼠上腫瘤生長(Tumor Growth)速率來觀察乳房細胞癌化的情況。
結果顯示，276位乳癌病人中有186位病人其第九型尼古丁受體在乳癌細胞的表現遠大於周邊正常乳房細胞的表現，總體來說大約有7.84倍的差距。持續性第九型尼古丁受體抑制的MDA-MB-231乳癌細胞株則明顯在細胞生長速率及細胞非貼附性生長的實驗中明顯受到抑制，將這些乳癌細胞株移植到小鼠(SCID mice)體內後我們也觀察到腫瘤的生長在抑制九型尼古丁受體後其乳癌腫瘤受到明顯的抑制 (每組五隻小鼠; 六周後Si alpha 9 cells的腫瘤大小 = 995.6 mm3, parental cells 的腫瘤大小 = 2993.2 mm3，差距 = 1997.6 mm3, 95% 信賴區間 = 1705 to 2290.2 mm3，P = .009)。 另外在MCF-10A正常乳腺細胞中長期添加尼古丁(Nicotine)及其活性物質4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone (NNK)可發現誘發乳房細胞癌化的現象發生。將這些癌化後的乳房細胞移植到小鼠體內後可觀察到大量表現第九型尼古丁受體的乳癌細胞其腫瘤生長速率會大量增長(每組五隻小鼠; 添加DOX組與是否添加尼古丁= 266.2 mm3 vs 501.6 mm3，差距= 235.4 mm3，95% 信賴區間 = 112.7 to 358 mm3，P = .009; 不添加DOX組與是否添加尼古丁= 621.2 mm3 vs 898.6 mm3，差距= 277.4 mm3，95% 信賴區間 = 98.1 to 456.7 mm3;P = .016; 添加尼古丁組與是否添加DOX = 501.6 mm3 vs 898.6 mm3，差距= 397 mm3，95% 信賴區間 = 241.3 to 552.6 mm3，P = .009)。
另外我們也嘗試找出第九型尼古丁受體(alpha 9-nAChR)表現受到雌激素(17 beta-estradiol，E2)所調控雌激素受體(Estrogen recepto，ER)的上下游表現關係。我們利用上述所提及的即時聚合酶鏈鎖反應及雷射擷取細胞技術來定量339位病人中乳癌和正常乳房細胞中第九型尼古丁受體的表現與雌激素受體表現與否的相關性。利用染色質免疫沉澱(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)的實驗我們發現雌激素受體會調節第九型尼古丁受體的轉錄藉以提高蛋白的生成。
我們觀察到乳癌細胞大量表現第九型尼古丁受體的病人(乳癌細胞比周邊乳房細胞達到十倍以上的差距)其五年術後存活率(5-year disease-specific survival rate)為最差的表現(約百分之五十，病人死亡/存活比值為4/4，共8位病人，P = 0.006)，而乳癌細胞微量表現第九型尼古丁受體的病人(乳癌細胞比周邊乳房細胞小於一倍的差距)則具有最好的五年術後存活率(約百分之八十八，病人死亡/存活比值為3/22，共25位病人，P = 0.006)。另外我們也發現乳癌細胞大量表現第九型尼古丁受體的病人也同時再乳癌細胞上也具有雌激素受體的表現(雌激素受體陽性比雌激素受體陰性，數量為160:72人，第九型尼古丁受體表現為11 ± 3比6.7 ± 2.3 倍)。
雌激素受體是一個十分著名的轉錄因子，因此我們也發現在MCF-7乳癌細胞中雌激素受體會結合到第九型尼古丁受體的啟動子位置(Promoter)上藉以調控尼古丁及雌激素所刺激的第九型尼古丁受體表現。總體而言，我們的研究發現尼古丁及雌激素活化雌激素受體且在調節第九型尼古丁受體的表現上扮演著重要的角色。 總體而言，我們發現第九型尼古丁受體在尼古丁以及雌激素調控乳房細胞癌化的細胞轉型中扮演著重要的角色。