整合微流體PCR 與次世代定序檢測C 型肝炎病毒NS3 基因突變率

根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)統計，截至目前為止全球有超過1 億7 仟萬人感染過C 型肝炎病毒(Hepatitis C virus)，而感染者往往發展成C 型肝炎，病程超過20 年的病患，其發病率和死亡率都與肝硬化和肝癌有關。因此，如何降低C 型肝炎病毒感染及有效清除病毒，以減緩肝硬化的進展及預防肝癌的發生，一直是全球關注的醫學議題。目前對於感染第1 型C 型肝炎病毒，常以長效型干擾素(pegylated IFN-alpha)與雷巴威林(Ribavirin)一起合併治療，成功率有40～50%，但因治療時間長與副作用嚴重，大幅限制了藥物的治療效果。2011 年有兩個第一代NS3/4A 蛋白酶抑製劑Telaprevir 和Boceprevir，已經被FDA批准用於治療第1 型慢性C 型肝炎，這一類新藥物被統稱為直接作用的抗病毒藥物(direct-acting antivirals DAA)，對於治療慢性C 型肝炎病毒有重要的發展與進步。然而，HCV 病毒顆粒的高遺傳多樣性與突變，會降低DAA 治療的敏感性，研究證實Resistance associated variants 經常發生在非常低的頻率(<5 %)。為解決此一問題，目前臨床試驗中最常見是以Sanger 定序做抗藥性突變分析，然而由於Sanger 定序方法不夠敏感，抗藥性突變頻率在20%至25%以下是檢測不到的，因此HCV 藥物開發諮詢組織(HCV Drug Development Advisory Group; HCV DRAG)建議，對於臨床評估新的DAA 抗病毒藥物的抗藥性，需要至少80 個克隆定序(Clonal sequencing)以檢測很低頻率的突變，但該方法費時又費力。本研究試圖整合微流體PCR 與次世代定序分析(Next Generation Sequencing，NGS）雙平台，期待可快速並準確提供高覆蓋率的突變分析檢測，並應用於新初始治療患者選擇合適的DAA 抗病毒藥物，以及新的DAA 抗病毒藥物的臨床研究用於監測治療前、中後的病毒準種的變異序列分析。
本研究中我們分析了24 個C 型肝炎病人檢體，針對NS3 Protease domain 執行Pyrosequencing，實驗結果顯示每個檢體在NS3 Protease domain 的所有Amplicon得到1230 至3627 之間序列讀取片段(Reads)，成功深度測序每一個相關抗藥性的variant，基因型1a 平均得到1237 倍的覆蓋率(Coverage depth)，基因型1b 平均得到942 倍的覆蓋率(Coverage depth)，報告顯示<1%低頻率的抗藥性突變存在，統計分析23 個感染HCV 的病患對NS3 抗藥性的突變率，在位點36 A/M 有16 個病患有突變發生突變率為69.5%；其他如 T54A/S 位點突變率為56.5%；V55A 突變率為78.2%；Q80K/R 突變率47.8%；R155K/T 突變率為39.1%；A156D/S/T/V突變率為43.4%；V170A 突變率為39.1%。並同時驗證此方法具有高精密性(High Precision)、高準確性(High Accuracy)及高特異性(High Specificity)。不僅可降低實驗成本與時間，更可以提供抗藥性variant 高準確度的深度測序分析。