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開發以組蛋白去乙醯酶為標靶之小分子藥物
Other Title
Development of small molecules targeting histone deacetylase
Type
thesis
Date Issued
2022-06-28
Author(s)
黃郁雯
Advisor
黃偉展
Subjects
系所名稱：生藥學研究所碩士班
Publisher
生藥學研究所碩士班
Description
口試委員：許銘仁 HSU, MING-JEN;許凱程 HSU, KAI-CHENG;黃偉展 HUANG, WEI-JAN
網際網路,開放日期為2022-07-14
網際網路,開放日期為2022-07-14
Abstract
當今的醫療保健中，與衰老相關的神經退化性疾隨著年齡增長，患者數目也越來越多，但目前並沒有有效的治療方法，並且仍有許多問題需要克服，因此本篇研究希望針對退化性神經疾病進行探討以及開發相關藥物。
本論文分為兩個部分：
I. 開發選擇性第IIa亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑
II. 開發組蛋白去乙醯酶proteolysis targeting chimera (PROTAC) 降解劑
I. 開發選擇性第IIa亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑
表關遺傳酵素中的組蛋白去乙醯酶 (histone deacetylase, HDAC) 能在功能上調節組蛋白以及去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 之間的交互作用力。而在眾多亞型中，過度表現第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶的酵素活性在神經退化性疾病中的作用至關重要，但是目前關於選擇性第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑的研究卻是較少。因此在本篇研究中，我們設計並且合成出一系列含有三環雜環的衍生物作為針對第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶酵素活性的選擇性抑制劑，其構想來自於過去我們實驗室所發表的強效第Ⅱ亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑WJH-2。與目前美國食品藥品監督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 核准之組蛋白去乙醯酶抑制劑伏立諾他 (vorinostat, SAHA) 以及WJH-2相比，此系列化合物除了能夠有效的地抑制第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶的抑制效果外，化合物9a在酵素抑制試驗中表現出最高的選擇性第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶 (selective class Ⅱa HDAC inhibition) 的抑制效果，針對第Ⅱa亞型中HDAC 7以及HDAC 9有最低的IC50 (HDAC 7 = 190 nM, HDAC 9 = 40 nM)。在西方墨點法試驗 (Western blot assay) 中顯示出化合物9a以及9b針對第Ⅱb亞型HDAC 6的受質微管蛋白 (tubulin) 及第Ⅰ亞型HDAC受質組蛋白 (histone) 乙醯化並沒有顯著性的影響。而化合物9a以及9b對於人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中沒有出現明顯的毒性，並且對過氧化氫誘導的細胞傷害具有神經保護的作用。因此這些體外試驗 (in-vitro) 數據顯示，化合物9a及9b為選擇性第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶的抑制劑，並且可作為治療神經退化性疾病之先導化合物 (lead compounds)，而延續進行其相關研究。
II. 開發組蛋白去乙醯酶proteolysis targeting chimera (PROTAC)降解劑
神經退化性疾病中，以阿茲海默症 (Alzheimer’s disease, AD) 的患者佔絕大多數，但其病因尚未釐清因此亟待繼續討論，其中有研究指出過度表現的組蛋白去乙醯酶6活性與阿茲海默症的病程具有高度的關聯。蛋白水解靶向嵌合體 (proteolysis targeting chimeras, PROTACs) 是含有兩種不同功能配體 (ligand) 的小分子藥物，其中一個配體能夠與目標蛋白質 (protein of interest, POI) 結合，另一個配體則用來結合 E3 連接酶 (E3 ligase)。藉由PROTAC藥物，E3 連接酶將得以靠近目標蛋白質並將其標記上泛素因子 (ubiquitin) ；帶有泛素標記的目標蛋白質會被蛋白酶體 (proteasome) 辨識切割降解為小片段蛋白質。本篇研究透過PROTAC藥物設計策略來開發一系列組蛋白去乙醯酶 6 的降解劑以達到降解蛋白的作用。該系列化合物在藥物酵素篩選試驗中均無表現出明顯的毒性，其中化合物30b透過西方墨點法試驗中顯示出具有高選擇性降解組蛋白去乙醯酶 6 蛋白的能力，並且於丙酮醛 (Methylglyoxal, MGO) 誘導SH-SY5Y細胞毒性之模式實驗中發現具有神經細胞保護作用，因此值得進一步釐清這些利用PROTAC策略所設計出的化合物其作用機轉，以討論其對阿茲海默症療效。
本論文分為兩個部分：
I. 開發選擇性第IIa亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑
II. 開發組蛋白去乙醯酶proteolysis targeting chimera (PROTAC) 降解劑
I. 開發選擇性第IIa亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑
表關遺傳酵素中的組蛋白去乙醯酶 (histone deacetylase, HDAC) 能在功能上調節組蛋白以及去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 之間的交互作用力。而在眾多亞型中，過度表現第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶的酵素活性在神經退化性疾病中的作用至關重要，但是目前關於選擇性第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑的研究卻是較少。因此在本篇研究中，我們設計並且合成出一系列含有三環雜環的衍生物作為針對第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶酵素活性的選擇性抑制劑，其構想來自於過去我們實驗室所發表的強效第Ⅱ亞型組蛋白去乙醯酶抑制劑WJH-2。與目前美國食品藥品監督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 核准之組蛋白去乙醯酶抑制劑伏立諾他 (vorinostat, SAHA) 以及WJH-2相比，此系列化合物除了能夠有效的地抑制第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶的抑制效果外，化合物9a在酵素抑制試驗中表現出最高的選擇性第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶 (selective class Ⅱa HDAC inhibition) 的抑制效果，針對第Ⅱa亞型中HDAC 7以及HDAC 9有最低的IC50 (HDAC 7 = 190 nM, HDAC 9 = 40 nM)。在西方墨點法試驗 (Western blot assay) 中顯示出化合物9a以及9b針對第Ⅱb亞型HDAC 6的受質微管蛋白 (tubulin) 及第Ⅰ亞型HDAC受質組蛋白 (histone) 乙醯化並沒有顯著性的影響。而化合物9a以及9b對於人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中沒有出現明顯的毒性，並且對過氧化氫誘導的細胞傷害具有神經保護的作用。因此這些體外試驗 (in-vitro) 數據顯示，化合物9a及9b為選擇性第Ⅱa亞型組蛋白去乙醯酶的抑制劑，並且可作為治療神經退化性疾病之先導化合物 (lead compounds)，而延續進行其相關研究。
II. 開發組蛋白去乙醯酶proteolysis targeting chimera (PROTAC)降解劑
神經退化性疾病中，以阿茲海默症 (Alzheimer’s disease, AD) 的患者佔絕大多數，但其病因尚未釐清因此亟待繼續討論，其中有研究指出過度表現的組蛋白去乙醯酶6活性與阿茲海默症的病程具有高度的關聯。蛋白水解靶向嵌合體 (proteolysis targeting chimeras, PROTACs) 是含有兩種不同功能配體 (ligand) 的小分子藥物，其中一個配體能夠與目標蛋白質 (protein of interest, POI) 結合，另一個配體則用來結合 E3 連接酶 (E3 ligase)。藉由PROTAC藥物，E3 連接酶將得以靠近目標蛋白質並將其標記上泛素因子 (ubiquitin) ；帶有泛素標記的目標蛋白質會被蛋白酶體 (proteasome) 辨識切割降解為小片段蛋白質。本篇研究透過PROTAC藥物設計策略來開發一系列組蛋白去乙醯酶 6 的降解劑以達到降解蛋白的作用。該系列化合物在藥物酵素篩選試驗中均無表現出明顯的毒性，其中化合物30b透過西方墨點法試驗中顯示出具有高選擇性降解組蛋白去乙醯酶 6 蛋白的能力，並且於丙酮醛 (Methylglyoxal, MGO) 誘導SH-SY5Y細胞毒性之模式實驗中發現具有神經細胞保護作用，因此值得進一步釐清這些利用PROTAC策略所設計出的化合物其作用機轉，以討論其對阿茲海默症療效。