雌激素抑制檸檬酸亞鐵增加小鼠腦血管內皮細胞誘導型一氧化氮上 升之分子機制探討

出血性中風造成腦損傷處可見紅血球及其代謝產物血紅蛋白、血紅素及鐵的堆積。先前之研究指出蜘蛛膜下腔出血 (subarachnoid hemorrhage; SAH) 會造成高濃度的二價亞鐵 (ferrous) 釋出，進而引起腦血管痙攣。過去利用老鼠蜘蛛膜下腔出血動物模式的研究指出增加第二型一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase 2; NOS2) 在腦血管組織的表現是造成腦血管痙攣之重要因子，然而對於出血如何增加第二型一氧化氮合成酶的表現之分子機轉尚未十分明白。因此，利用檸檬酸亞鐵 (ferrous citrate; FC)來刺激小鼠腦血管內皮細胞(cerebral endothelial cells; CEC)以模擬蜘蛛膜下腔出血時高鐵濃度對血管內皮細胞的反應來探討蛛網膜下腔出血如何引發NOS2表現增加的相關議題。利用免疫細胞化學染色技術 (immunocytochemical staining technique)，我們首先證實了小鼠腦血管內皮細胞可表現第二型一氧化氮合成酶。而且投予檸檬酸亞鐵 (100 μM)可增加小鼠腦血管內皮細胞內活性氧自由基 (reactive oxygen species; ROS)的濃度、核因子κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; NFκB)由細胞質轉移至細胞核的量及核因子結合到第二型一氧化氮合成酶啟動子的量，進而造成第二型一氧化氮合成酶的信使核糖核酸 (mRNA) 和蛋白表現增加。然而事先投予細胞活性氧清除劑 N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine; NAC）則可抑制這些由檸檬酸亞鐵所引發的作用。在本研究裡，我們證實了在第二型一氧化氮合成酶啟動子上有兩個先前預測的核因子κB 結合位點分別是在-1529 bp至-1516 bp及-1224 bp至-1210 bp的範圍。有趣的是，核因子κB結合位點參與了FC-NOS2激活的轉錄活性。然而於小鼠腦血管內皮細胞細胞中，位於-1529 bp至-1516 bp處的核因子κB結合位點比位於-1224 bp至-1210 bp的結合位點發揮更大的作用。上述的發現闡述了檸檬酸亞鐵增加第二型一氧化氮合成酶在小鼠腦血管內皮細胞表現的可能分子機制。
接著，我們利用這種細胞模式來探討雌二醇（estradiol; E2）對於蜘蛛膜下腔出血引發的血管痙攣的保護作用。先前利用二次注射血液引發蜘蛛膜下腔出血的動物模式研究發現雌二醇可透過抑制第二型一氧化氮合成酶表現而顯著的減弱蛛網膜下腔出血引起的血管痙攣。本研究發現檸檬酸亞鐵會刺激第二型一氧化氮合成酶2的上升主要是因透過增加活性氧自由基的產生，而增加核因子κB由細胞質轉移至細胞核內。我們進一步探討雌二醇如何調控檸檬酸亞鐵刺激第二型一氧化氮合成酶增加的影響。研究發現，給予小鼠腦血管內皮細胞100 nM濃度的雌二醇時會減少由檸檬酸亞鐵誘導形成的活性氧自由基產生及第二型一氧化氮合成酶的信使核糖核酸和蛋白的表現量增加的現象。 此外，雌二醇也抑制了因檸檬酸亞鐵的誘導而增加小鼠腦血管內皮細胞的IκBα磷酸化、核因子κB的細胞核內遷移、核因子κB結合到第二型一氧化氮合成酶啟動子、以及第二型一氧化氮合成酶啟動子的量。然而使用RNA干擾模式 (siRNA) 阻斷雌激素受體β（ERβ），會抑制雌二醇預防檸檬酸亞鐵刺激造成的 第二型一氧化氮合成酶 信使核糖核酸和蛋白質表現增加的現象，而抑制ERα的表現則無此現象。依據現今研究的結果，我們證實了雌二醇抑制第二型一氧化氮合成酶基因表達是藉由干擾核因子κB的細胞核內遷移和核因子κB結合到第二型一氧化氮合成酶啟動子上。
本論文的研究結果或許可提供臨床上藉由調控第二型一氧化氮合成酶的表現為因蜘蛛網膜下腔出血引發血管痙攣患者提供適用的預防或治療策略。