具抑制血管新生功效之標靶型兒茶素奈米藥物作為抑制角膜血管新生之眼藥治療效果評估

實驗背景： 角膜血管新生(Corneal neovascularization，Corneal NV)是指病理性的血管構造新生在角膜組織上進而影響視力，當角膜的透明度受到新生血管的影響時，視力的清晰度就會降低，如果缺乏適當的治療，嚴重時可能導致失明。現今治療Corneal NV的療法包含皮質類固醇（corticosteroid）,抗血管內皮生長因子（VEGF）療法(anti-angiogenesis) 以及角膜移植手術。在眾多治療方式中，以眼藥水給予抗血管新生藥物是較被傾向的。表没食子兒茶素沒食子酸脂(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG) 是一種主要的茶多酚，具有抗發炎，抗氧化以及抗血管新生效果適用來抑制異常血管增生。(Arginine-glycine-aspartic acid) (RGD) peptide(精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸), 能達到與血管內皮細胞的表面的整合素v3特異性結合。現今藥物以眼藥水形式給藥於眼表停留的藥物成分只有不到 5 %，奈米技術可以用來提高藥物於眼表濃度來有效治療眼科疾病，我們假設以茶多酚兒茶素以及RGD peptide 為原料製備的奈米粒子能有效的治療角膜血管新生疾病。
實驗目的：研究gelatin-EGCG 奈米粒子（GE）以hyaluronic acid-RGD表面修飾成的奈米粒子，縮寫為 GEH-RGD，於人類臍帶血管內皮細胞（HUVECs）的增生及功能性的抑制效果。藉由Corneal NV小鼠活體實驗確認GEH-RGD 奈米粒子眼藥水的治療效果。
材料與方法： EGCG 溶液與明膠溶液在適當的比例之下混合形成自組裝的奈米粒子。透明質酸與RGD peptide 以crosslinker 先做接枝反應，然後覆蓋於自組裝的奈米粒子表面上。人類臍帶血管內皮細胞(HUVECs)被選用於實驗，GEH-RGD奈米粒子被加入與細胞共同培養，評估測驗在不同時間點被執行。細胞爬行, 細胞侵襲與管柱形成實驗被用來評估GEH-RGD的抑制效果。西方墨點法（Western blotting）被用來來測試HUVECs 細胞裂解液中的血管內皮生長因子（VEGF）的含量，明膠酶譜法(Gelatin Zymography)被用來測試HUVEC 培養液中基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase（MMP） 2 & MMP-9）的活性。 C57BL/6 小黑鼠，被選擇來建立化學灼傷的角膜血管新生動物模型，接著以奈米粒子眼藥水治療，一天兩次，療程持續一星期。 外表評估(visual grading)，全標本包埋（whole mount）, 酵素免疫分析法(ELISA), 組織切片-蘇木素-伊紅染色（H&E staining）和細胞凋亡分析（TUNEL assay）等方法被用來評估治療效果。
實驗結果: 從實驗結果中來看，細胞移行，細胞侵襲和管柱形成實驗顯示相較於EGCG溶液及未以RGD修飾的GEH 奈米粒子，以RGD修飾的奈米顆粒(GEH-RGD)對於人類臍帶血管內皮細胞具有最明顯的抑制血管新生的效果。明膠酶譜法證明GEH-RGD 有較好抑制MMP2 & MMP9 酵素的活性。在小鼠動物實驗中，所有組別皆有從邊緣血管(limbus vessel)長進眼角膜異常的血管增生的現象。相較於PBS，EGCG溶液以及GEH奈米粒子組，GEH-RGD 奈米粒子組中異常的新生血管相對較細也較稀疏。全組織標本包埋(wholemount)顯現出與外表評估的同樣趨勢。小鼠的角膜組織以均質機萃取蛋白質， ELISA 實驗中顯示含有EGCG的各個治療組相較於PBS 對照組皆有明顯抑制 VEGF的功效，而其以中GEH-RGD 組中表現量為最低。組織切片 H&E staining的結果顯示組織的完整度也以GEH-RGD 組最接近未誘導疾病的正常小鼠。
結論：GEHRGD奈米粒子能夠有效減少HUVECs 的增生，遷移和管柱形成能力。在動物實驗當中，GEHRGD 粒子透過減少VEGF 的表現量以及抑制MMP2&9 的活性來減少病理血管的生成。 GEH-RGD 在所有的組別之中擁有更好的療效。本實驗能提供一個新的治療策略來治療角膜血管新生疾病並可能地克服傳統眼藥水形式治療方法的不足。