凝血酶刺激人類肺部纖維母細胞結締組織生長因子表現的分子機制探討

凝血酶 (thrombin) 在肺部發炎及肺部疾病中扮演相當重要的角色。Thrombin可以刺激肺部纖維母細胞表現結締組織生長因子 (connective tissue growth factor, CTGF)。也有研究證實CTGF過度表現會誘導肺部纖維化的發生。然而，關於thrombin誘導CTGF表現的訊息傳遞路徑仍未詳細研究。首先，本論文將深入探討apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1)、JNK與AP-1等訊息傳遞蛋白在thrombin刺激人類纖維母細胞CTGF表現的角色。我們發現在正常成人肺部纖維母細胞和人類胚胎肺部纖維母細胞株 (WI-38 細胞) 中，thrombin以濃度與時間相關性來刺激CTGF的蛋白表現與分泌。此外Thrombin也會增加CTGF mRNA與CTGF luciferase activity。Thrombin誘導的CTGF蛋白表現與CTGF luciferase activity可以被PAR1抑制劑 (SCH79797)、ASK1與JNK1/2顯性突變質體 (the dominant-negative mutants, DNs) 和AP-1抑制劑 (curcumin) 所抑制。Thrombin 會誘發ASK1 Ser967去磷酸化、ASK1與14-3-3解離而增加ASK1激酶活性。thrombin也能誘發JNK磷酸化和激脢活性增加，此現象會被ASK1DN所抑制。進一步發現，thrombin誘導的ASK1與JNK激脢活性可以被SCH79797所抑制。Thrombin誘導的CTGF luciferase activity大部分受到其promoter上-747到-184特定區域的調控 (包含兩個AP-1的特異結合序列)。若將此兩個AP-1特異結合序列突變，則會抑制thrombin刺激的CTGF luciferase activity。深入研究發現，thrombin也能增加c-Jun 磷酸化、AP-1特異性DNA-蛋白複合體，並且增加AP-1細胞內 (in vivo) DNA特定序列結合能力。Thrombin誘發的AP-1活化也可以被SCH79797、ASK1DN、JNK1/2DN與SP600125所抑制。由以上的結果顯示，在肺部纖維母細胞中，thrombin會經由PAR1活化ASK1/JNK/c-Jun/AP-1訊息傳遞路徑，促使AP-1與CTGF promoter特定序列結合來起動CTGF基因的表現，進而誘發CTGF表現與釋放。
我們接下來繼續探討Ras、Raf-1、ERK、IKKa/b與NF-kB等蛋白在thrombin刺激人類纖維母細胞CTGF表現的訊息傳遞機制中所扮演的角色。我們發現thrombin刺激的CTGF表現可以被MEK抑制劑 (PD98059) 抑制，然而p38MAPK抑制劑 (SB203580) 卻沒有影響。此外，CTGF表現還會被Ras抑制劑 (manumycin A)、Raf抑制劑 (GW5074)、IkB?捘C酸化抑制劑 (Bay117082) 和IkB顯性突變質體 (IkBM) 所抑制。Thrombin 誘導的CTGF luciferase activity也會被manumycin A、GW5074、PD98059和Bay117082所抑制。進一步發現，Thrombin能誘發Ras活性、Raf-1與IKKa/b磷酸化增加，而且Raf-1磷酸化程度可以被manumycin A所抑制。Thrombin也會使ERK磷酸化增加，此反應會被manumycin A與GW5074所抑制。此外，我們也發現thrombin誘發的c-Jun磷酸化增加也會被PD98059所抑制。從這部分的實驗結果我們證實在WI-38細胞當中，thrombin可能經由活化Ras/Raf-1/ERK/c-Jun與IKKa/b/NF-kB等訊息傳遞路徑，進而誘發CTGF表現與釋放。
綜合以上所有研究結果，這是第一次發現在人類肺部纖維母細胞中，thrombin會經由PAR1活化ASK1/JNK/c-Jun/AP1、Ras/Raf-1/ERK/c-Jun與IKKa/b/NF-kB等訊息傳遞路徑，共同啟動CTGF promoter來促使基因表現，最終導致CTGF蛋白大量表現與釋放。