探討以聚合微膠體 製成劑型之質體 DNA 進入細胞的機轉

本實驗目的為初步探討質體DNA在含有三嵌段式共聚合物 (triblock copolymer) 之下進入RAW 264.7 巨噬細胞的機轉。利用七種抑制劑：(1) 醋酸 (2) chlorpromazine (3) PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) (4) amiloride (5) ammonium chloride (6) chlroquine (7) cytochalasin B，分別阻斷內吞作用 (endocytosis) 的不同路徑calthrin-mediated endocytosis (CME)、caveolae-mediated endocytosis、macropinocytosis 及 clathrin- and caveolin-independent endocytosis。
在利用 MTT assay及 Apoptotic array 分析聚合微膠體對於細胞的毒性下，MTT 結果顯示，於聚合微膠體2-24 小時作用下，與 control組無差異；而經48 小時作用後，凋亡相關基因的mRNA有7個 pro-apoptotic gene 及2個anti-apoptotic gene上升，而在顯微鏡下觀察細胞的形態，加聚合物的組別和control組無差異，因此可知聚合物對細胞沒有毒性。
藉由萃取細胞的 total DNA，進行 PCR (polymerase chain reaction)，放大 Lac Z 片段，以跑電泳方式呈現質體 DNA進入細胞中的量。初步結果顯示，加入 P/ PM (plasmid DNA/ Polymeric micelles) 後，在不移除P/ PM的情況下，於2 - 4小時偵測到質體 DNA 在細胞內的量達到最高，而8, 12, 24小時下降，其降解速率為 0.0014 ?b 0.00017 min-1。若是加入 P/ PM 2 小時後即移除，則質體 DNA 在細胞中的量隨時間增加而減少，其降解速率為 0.0012 min-1。
此外，將帶有 FITC 螢光的奈米顆粒 (nanoparticle) 與superfect混合質體DNA 個別加入培養液中，結果顯示，兩者進入細胞均隨著時間增加。存在於DNase 中的質體DNA在PM下的保護效果可由1小時增加至3小時。
以抑制劑處理細胞後再加入P/ PM，在不同時間下分析質體 DNA，結果顯示抑制clathrin-mediated endocytosis的醋酸及藉由干擾actin polymerization非選擇性抑制胞飲作用的cytochalasin B有抑制質體DNA進入細胞的效果，且其機轉與clathrin-mediated endocytosis 有關；而 chloropromazine、NH4Cl、chloroquine 及 PMA對 P/ PM 的進入無影響；而加入 amiloride 則是在 24 小時細胞中的質體 DNA 的量顯著增加。
由上述結果推測， P/ PM 主要由clathrin-mediated endocytosis 進入細胞。