腸道分離菌 Bacillus licheniformis No.TMI-H1221 生理活性代謝物之探討

地衣芽孢桿菌(Ｂacillus licheniformis)為芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)中被視為人體益生菌(Probiotics)的菌種，這些益生菌可藉由表現細胞表面分子或釋出其代謝產物，與腸道細胞相互作用而對腸道形成保護屏障。本研究目的針對地衣芽孢桿菌經由發酵產生的活性代謝產物，進行其成分的追蹤分離純化與分子結構解析，以期了解此菌種在人體腸道中所扮演防疫的功能及其作用機制。
實驗規畫分為：1.發酵最適化條件設計；2.以抗菌活性能力及清除自由基能力篩選發酵條件；3.活性代謝物分離純化；4.活性代謝物性狀分析與鑑定，等四個部分。
實驗中以腸道分離菌株Bacillus licheniformis No. TMI-H1221(簡稱BL菌株)為對象分別進行液態振盪發酵以及液態靜置發酵。發酵產物經抗菌活性以及自由基清除能力試驗篩選結果，確立此菌株最適發酵條件為：1.發酵培養基為 M1培養基，其成分以酵母膏、蛋白腖、葡萄糖為主；2.發酵溫度37℃，以振幅75rpm液態往復振盪發酵3天；3.發酵容積比為1.5L/5L(v/v)三角錐形瓶。
活性代謝物回收流程為：發酵培養液經離心取得上清液後，以ethyl acetate進行酸鹼萃取分層，呈現活性之強酸萃取層再經silica gel 60F管柱液相層析(CLC)進行活性物質分離，可於chloroform: methanol: acetate = 100:0:1沖堤區段中取得粗分之活性畫分。續以silica gel F254薄層液相層析(TLC)分離，以benzene: methanol= 90:10展開後再經刮除及ethyl acetate溶離濃縮可得一活性純化物，命名為BL-A-01。此物質經結構分析鑑定，確認為過去所知的同菌種抗菌代謝物phenylacetic acid。接續上述之沖堤液chloroform: methanol: acetate = 95:5:1分離區段中可得另一粗分活性畫分，此畫分經silica gel F254 TLC分離，以chloroform: methanol: acetic acid = 80:20:1展開後在Rf=0.6處可得一活性純化物，命名為BL-A-02。此物質經HPLC分析後發現為有別於phenylacetic acid之新成分，其純度並以氣相層析(GC)做進一步確認。此外在中弱酸層可另得一無色針狀結晶，此結晶可經溫熱ethyl acetate進行再結晶提純處理，特將其命名為BL-N-01。
針對上述所純化之三個BL菌株代謝物質，檢討其生物及物化特性可知：BL-A-01能抑制Staphylococcus aureus (SA)，methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA)及Candida albicans (CA)之生長，其紫外最大吸光值(UVmax)為280nm。BL-A-02能抑制SA生長，對MRSA及CA則無抗菌能力，其UVmax為236及278nm。BL-N-01則不具任何抗菌活性，其熔點為198~200℃，UVmax為210nm。本研究由探索人體腸道益生菌Ｂacillus licheniformis發酵代謝產物之角度，針對此菌株活性代謝物之生物特性及分子結構進行解析，以作為其將來在腸道免疫防疫功能及藥物發展研究之重要參考。