小鼠精子獲能反應過程之磷酸化蛋白質體分析

隨著全球生育率下降，不孕症近年來已成為眾人關注的議題，其中男性因素佔所有不孕症發生的原因近50%，而精子功能障礙又是男性不孕症最常見的原因。先前的研究指出精子蛋白質磷酸化的缺乏，可能是造成精子功能障礙的原因之一。具有正常活動力及型態的精子經獲能反應過程，進行蛋白質磷酸化轉譯後修飾才具有完整受孕能力，其中以蛋白質酪胺酸磷酸化對精子功能調節最為重要。精子接受獲能反應的時間長短，被認為有可能會對精子活動力造成不同程度上的影響，但對於精子蛋白質磷酸化的影響則尚未有定論。本研究目的主要在探討獲能反應對精子蛋白質磷酸化之影響；並進一步鑑定蛋白質胺基酸磷酸化位置的變化。研究方法：本研究所分析之精子由小鼠副睪取出後，經HEPES培養液清洗而取得品質較佳的精子。精子在獲能反應前 (0分鐘) 和獲能反應經過60、90分鐘分別檢測其活動力後，萃取其蛋白質後再利用二氧化鈦磷酸化純化(titanium dioxide phosphorylation enrichment )與液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS) 分別搭配搜尋引擎MASCOT/Proteome discovery (PD)和Andromeda/MaxQuant來分析小鼠精子獲能反應過程中蛋白質磷酸化的變化情況。研究結果：使用MASCOT/PD軟體分析鑑定精子磷酸化蛋白質共65個，其中獲能反應前有37個，而獲能反應60、90分鐘分別有42、56個；隨著獲能反應的時間增長，進行轉譯後修飾磷酸化的蛋白質也越多。針對同一批質譜資訊，MASCOT/PD能夠對應出較多的磷酸化位置，而Andromeda/MaxQuant則是可以對應到較多的蛋白質。在蛋白質AKAP4發現在獲能反應前有30個胺基酸位置為磷酸化狀態，而獲能反應60、90分鐘分別有34、40個胺基酸位置為磷酸化狀態；顯示隨著獲能反應的時間增長，AKAP4鄰酸化的程度也越高。另外本研究在AKAP4新發現81個胺基酸磷酸化，其中有56個絲胺酸 (serine，S)、7個酪胺酸 (tyrosine，Y)、8個蘇胺酸 (threonine，T)、6個天門冬胺酸 (aspartic acid，D) 與4個組胺酸 (histidine，H)。這些AKAP4新發現的磷酸化胺基酸當中，第156個胺基酸 (酪胺酸，Y156) 在獲能反應60與90分鐘有發生磷酸化但獲能反應前並未被搜尋對應到，經由這樣的觀察，暗示Y156的磷酸化可能參與精子Rho訊息傳遞路徑。結論：本研究有新發現小鼠精子蛋白質AKAP4胺基酸磷酸化的位置；而不同獲能反應時間也會觀察到蛋白質與胺基酸磷酸化位置與數目的消長。有關精子獲能反應時蛋白質胺基酸磷酸化表現以及這些被磷酸化的蛋白質在小鼠精子生理機轉所扮演的角色，未來還需要更多的研究來探討。