枸杞多醣體對精子蛋白磷酸化的影響

精子若不能充分產生或運用能量，將可能影響活動力甚至會出現精子無力症(asthenozoospermia)的現象。人類精子隨著葡萄糖濃度增加跟精子活動力曲線呈現吊鐘形狀；高濃度葡萄糖 (25 mM) 可以增加小鼠精子活動力，且可能與精子蛋白質磷酸化作用有關。過去研究發現枸杞可以改善受到高溫影響的精子生成，枸杞多醣也能夠螯合亞鐵(Ferrous)且隨著濃度增加。本研究目的在探討枸杞多醣體粗萃取物醣的特性組成及其螯合能力與細胞活性，並探討多醣體不同分子量的區分物(fractions)的鐵螯合作用；並利用小鼠精子磷酸化蛋白質體探討枸杞粗多醣的影響。方法：1)萃取純化與活性：本研究所使用水萃的方式進行枸杞多醣萃取，通過分子篩層析(size exclusion gel filtration)得到多醣區分物，並使用氣相層析質譜儀(GC/MS)、呈色法進行組成分析、亞鐵螯合能力。小鼠精子活動力分析則需先由ICR小鼠副睪取出並篩選取得品質較佳的精子。首先將小鼠精子分成四組，分別培養於含有葡萄糖、枸杞粗多醣(14.04 mg/mL；相當於葡萄糖25 mM)、亞鐵離子溶液、亞鐵離子溶液加枸杞粗多醣，經過0、30、60、90、120分鐘後以電腦輔助精子分析儀 (computer assisted sperm analysis)進行活動力的分析；2)枸杞粗多醣的精子磷酸化蛋白質體：則將測試後並萃取得到的精子蛋白利用二氧化鈦磷酸化純化(titanium dioxide phosphorylation enrichment )，以液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)搭配搜尋引擎Andromeda/MaxQuant進行分析。結果：1)枸杞粗多醣經分子篩層析後得到LBP1、LBP2及LBP3三種區分物，分別以不同比例的7種單醣Arabinose、Rhamnose、Fucose、Xylose、Mannose、Galactose以及Glucose組成。枸杞粗多醣2.3 mg/mL能螯合6 nmole亞鐵離子，而枸杞粗多醣溶液(10 mg/mL)也能減少亞鐵離子(40 uM)精子活動力下降，於90分鐘改善10%。枸杞多醣其區分物LBP1、LBP2以及LBP3 在相同濃度下(0.46mg/mL)的亞鐵螯合率分別為18.2%、62.14%及95.75%。枸杞粗多醣溶液濃度(14.04 mg/mL)在90分鐘較等量的葡萄糖分別維持59.0% vs. 45.5%精子起始活動力；2)枸杞粗多醣液培養90分鐘後的樣品，有49筆胺基酸被磷酸化(21個為新發現的位置)，所對應到具轉譯後蛋白質磷酸化修飾為21個蛋白質。結論：枸杞粗多醣 (14.04 mg/mL)在90分鐘較等量的葡萄糖能延長精子活動力持續的時間；鑑定到21個新的精子蛋白質磷酸化位置；枸杞粗多醣有鐵螯合的能力可以保護精子細胞免於受到亞鐵的傷害，且鐵螯合能力主要來自於LBP3。希望未來可以進一步確認誘發磷酸化作用定量趨勢及其機制，以及枸杞多醣中LBP3鐵螯合有效活性之化學結構。