食用麴菌所生產對大腸直腸癌細胞具TRAIL凋亡誘導致敏性的新型發酵產物篩選研究

本研究針對食用麴菌(edible koji)，包括製造日本清酒專用的米麴菌(Aspergillus oryzae)、泡盛麴菌(Aspergillus awamori)…等，進行與各種培養基質的發酵組合，以探討其應用在新天然抗癌藥物開發的可行性；研究標的著眼於能增強腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)誘導癌細胞凋亡效果的致敏因子(senisitizers)。標的活性物質的篩選及追蹤指標包括：1.抗細菌活性試驗；2.自由基清除和抗氧化能力試驗；以及3.含硫醇基化合物N-acetylcysteine (NAC)和還原態glutathione (GSH)對生物活性的拮抗現象等觀測。根據篩選實驗結果，選定以泡盛麴菌發酵SDB 培養基的組合做為標的活性物質的生產條件。當菌種發酵上清液經乙酸乙酯(ethyl acetate)酸鹼轉溶萃取分層時，在萃取中性層(neutral fraction)可得到符合上述篩選指標的活性成分；進一步以矽膠(silica gel)管柱層析進行活性物質分離，以階段梯度沖堤，在正己烷(n-hexane)：乙酸乙酯=70：30處可得到最佳的活性表現區段，其中尤以區段No.20的活性表現最佳。此區段在室溫靜置過程中可形成無色針狀結晶，且證實此結晶物質具有降低人類大腸癌細胞HT-29存活率及增加TRAIL所誘導HT-29細胞凋亡之效果。針對此活性區段，再經矽膠薄層層析(TLC)分析後，可確定展開溶劑為苯(benzene)：乙酸乙酯：甲醇(methanol) =70：25：5，於展開阻滯值(retention factor, Rf ) 0.59處，UV254波長下可觀測到呈現明顯吸收的單一成分存在，此即為標的活性物質的純化物。以C18管柱為固定相的逆相高效能液相層析(HPLC)分析結果顯示，以UV254波長檢測，於水：甲醇=80：20沖堤條件下，可觀測到完全分離的兩個吸收峰，分別命名為 No.AWM-N01與No.AWM-N02。上述兩成分再經過製備級C18逆相HPLC的分離純化收集，可得到兼具抗細菌及NAC與GSH拮抗活性的No.AWM-N01，以及僅具有抗細菌活性的No.AWM-N02兩個活性成分，兩者的純度均接近100 %。No.AWM-N01的FT-IR圖譜顯示，在1724 cm-1 (sharp, w, C=O)、1648 cm-1 (sharp, w, C=C)可分別觀測到微弱但明顯的羰基及碳雙鍵官能基特性的吸收峰，推測No.AWM-N01為帶有α,β-共軛不飽和羰基(α,β-unsaturated conjugated carbonyl group)的化合物，此分子結構特性符合本研究初始所設定的篩選條件。本研究已證實食用麴菌在開發新型TRAIL細胞凋亡誘導致敏性天然藥物的可行性。