鑑定 p53 在 p27 promoter 上的調控位置

血管增生 (Angiogenesis) 是原先已經存在血管中的內皮細胞受血管增生因子刺激往外增生構成新血管的過程。過去研究指出，女性性荷爾蒙也能夠調控生理性血管增生的現象。由於人類的血管內皮細胞內存在有助孕酮接受體 (progesterone receptor, PR)，因此我們推測 progesterone 可能參與調控內皮細胞的行為。本實驗室先前已證實人類臍靜脈內皮細胞 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) 給予 Progesterone (500 nM)刺激後會藉由 p53 蛋白所引起的訊息傳遞，使得細胞 DNA 生合成受到抑制。p53 蛋白會促進 cyclin-dependent kinase inhibitor p21CIP 以及 p27KIP1 基因表現，使 cyclin-dependent kinase 2 其複合物的活性受到抑制，造成細胞週期無法進入 S-phase 進行 DNA 複製而抑制細胞的增生。分子機轉的探討上在過去已經有文獻清楚描述 p53 蛋白能直接結合在 p21 啟動子 (promoter) 的75 bp 以及 2.4 Kb 位置上並活化基因表現。然而 p53 蛋白如何調控 p27 基因表現，過去並沒有相關文獻報導。先前我們實驗室發現 p53 蛋白可以增加 p27 promoter activity 進而促進 p27 mRNA 和蛋白質表現量增加，我們也證實 p53 蛋白是透過結合在 p27 promoter 上來活化基因表現。
因此本篇論文研究更進一步探討，Progesterone 刺激下，細胞內 p53蛋白真正結合在 p27 promoter 上的位置。為了分析 p27 promoter 上 p53 蛋白的結合範圍，因此我們將兩段不同長度的 p27 promoter 片段構築在 luciferase 報告基因表現載體上，結果我們發現 p53 蛋白結合位可能位在p27 promoter 的 -258 bp 到 -310 bp 之間。進一步針對這範圍內 p27PF-Δ1、p27PF-Δ2、p27PF-Δ3 三段可能 p53 蛋白會辨認結合的序列，利用序列鹼基 deletion 技術各別移除其中的一段序列，同樣透過建構 luciferase gene 表現載體來分析，結果發現細胞給予 Progesterone 刺激之後，三個突變型 p27 promoter 表現載體的 luciferase 基因活性相較於對照組都沒有增加。這結果表示 p53 蛋白要辨認結合到 p27 promoter 上，可能需要 p27PF-Δ1、p27PF-Δ2、p27PF-Δ3 這三段序列都要存在。
另外我們經由染色體免疫沉澱法結果卻發現HUVEC 細胞給予 progesterone 刺激下，PR 能夠結合在缺乏典型 progesterone responsive element (PRE) 的 p27 promoter 上。而且透過核蛋白的免疫沉澱結果發現，細胞給予 Progesterone 刺激後，細胞核內的 PR 與 p53 蛋白之間的結合量相較於對照組有明顯增加。因此這實驗結果顯示 PR 蛋白可能也參與調控 p27 基因的活化過程。
總結本實驗結果，在本研究中我們進一步瞭解 p53 蛋白誘導促進 27 基因的表現是經由辨認結合在 p27 promoter 的 -258 bp 到 -310 bp 之間。此外，我們的實驗結果也發現 PR 可能透過與 p53 蛋白結合而間接結合到 p27 promoter 上，但是 PR 是否真正影響到 p27 基因的表現這還必須進一步探討。