探討鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯長期低劑量暴露對肝星狀細胞與肝纖維化的影響

塑化劑常被添加於塑膠製品以增加彈性，其中DEHP (Di-(2-ethylhexyl) phthalate) 為常見的塑化劑之一。然而塑化劑易釋放於環境中，被生物體吸收，並導致代謝、生殖、神經發展等疾病。美國環境保護協會以及歐盟均有規範每人每天可食入的DEHP劑量為20 μg/kg及37μg/kg，而一般人每日從各個環境中暴露的量約30 μg/kg，但是長期使用醫療器材例如洗腎的病人暴露的量卻可高達457 μg/kg，台灣塑化劑風暴中塑膠製品DEHP含量則約30-100 ppm。肝臟為人體內主要代謝的器官，過去研究發現DEHP暴露會使肝實質細胞發炎增生，並走向細胞凋亡途徑，暴露DEHP的大鼠肝臟組織發炎浸潤增加、膽固醇代謝相關的蛋白表現量下降，血清中膽固醇增加。但眾多研究偏向短期高劑量暴露，而非符合實際生活中的長期低劑量暴露。由於膽固醇堆積是導致肝纖維化的重要危險因子，因此，本篇研究欲了解長期低劑量暴露DEHP對肝星狀細胞以及肝纖維化的影響。
首先，我們使用大鼠肝星狀細胞 (HSC-T6) ，短期暴露濃度0、50、100、250、500、1000、5000 μM 的DEHP共6天，發現較高劑量 ( >250 μM) DEHP暴露的肝星狀細胞在第6天生長抑制達80 %，具有細胞毒性。因此我們建立低濃度 (50及100 μM) 的長期暴露DEHP的HSC-T6細胞，發現長期低劑量暴露DEHP的HSC-T6細胞型態會些許變尖，膽固醇會堆積在細胞內，且與膽固醇代謝相關的蛋白與基因，如與膽固醇攝入有關的SR-B1、膽固醇運輸的NPC1、將膽固代謝成膽酸的CYP7A1、酯化膽固醇的ACAT1、將膽固醇排出的ABCA1、ABCB11、ABCG1的表現量均下降，而膽固醇運輸的NPC2表現量上升，內生性合成膽固醇的HMGCR及SREBP2表現量也會上升。此外，加入PDGF-BB去刺激，會使正常的HSC-T6細胞生長會加速，但是長期低劑量暴露DEHP的HSC-T6細胞生長卻較慢，且對PDGF-BB的刺激感受性較弱，其下游訊息傳遞鏈的ERK、JNK及p38蛋白磷酸化也會減少。利用流式細胞儀分析也顯示長期低劑量暴露DEHP的HSC-T6細胞凋亡的比率有增加，Caspase-3及PARP蛋白切除片段以及Bax的mRNA表現量也有增加，而anti-apoptotic相關的Bcl-2 mRNA表現量則是不變。由於細胞凋亡與粒腺體運作息息相關，因此利用海馬生物能量分析儀，發現長期低劑量暴露DEHP的HSC-T6細胞，其ATP製造、粒腺體最大運作能力以及基礎耗氧量均比正常的細胞來的少，表示長期低劑量暴露DEHP會使肝星狀細胞粒腺體功能受損，並可能產生氧化物的堆積，而導致細胞凋亡。最後，將C57BL/6公鼠分成六組：控制組、四氯化碳組 (2 ml/kg，2次/週，7週)、DEHP 5 mg/kg (6次/週，12週)、DEHP 5 mg/kg與四氯化碳組、DEHP 500 mg/kg (6次/週，12週)、DEHP 500 mg/kg與四氯化碳組。發現雖然長期暴露DEHP的小鼠肝臟組織型態無顯著變化，膽固醇也無明顯堆積，但是與膽固醇攝入有關的SRB1、運輸相關的NPC1、膽固醇排出的ABCA1及ABCB11的表現量下降，而內生性合成的HMGCR表現量則無差異。而長期暴露DEHP的小鼠體重也會顯著下降，再加入四氯化碳後下降程度更明顯。此外，長期暴露DEHP並給予四氯化碳的小鼠，比起只有四氯化碳組小鼠的肝組織細胞核有異常增大的現象、脂肪空泡形成、發炎浸潤、膽固醇堆積、血清中ALT的量增加、纖維蛋白堆積。由本研究結果可知，長期低劑量暴露DEHP會使肝星狀細胞型態些許變尖，且膽固醇代謝會受到影響並導致膽固醇的累積，細胞生長速度也較慢，且對PDGF-BB刺激反應較差，細胞粒腺體功能喪失而導向細胞凋亡，而動物實驗也證實長期暴露DEHP會使小鼠肝臟膽固醇代謝受影響而堆積膽固醇，並加速四氯化碳所誘導的肝纖維化及肝損傷。