轉錄因子 nuclear factor kappa B 在凝血酶活化人類血小板中所扮演的機轉探討

轉錄因子(NF-KappaB)可控制有核細胞的生存與死亡，並且與免疫和發炎反應有關，然而對於其在無核細胞中所扮演的角色至今仍不清楚。本研究詳細探討凝血酶(thrombin)如何刺激無核細胞(血小板)中轉錄因子(NF-κB)活化，進而造成血小板凝集。Thrombin是一種強效血小板活化劑，對於止血和血栓形成扮演著重要的角色。Thrombin活化血小板，主要是透過protease-activated receptor1（PAR1）和PAR4。然而，在血小板中，PAR1和PAR4的下游訊息目前尚未清楚。在本研究中，利用3-OMS（neutral sphingomyelinase抑制劑）以及Bay11-7082 (NF-κB抑制劑)，皆能顯著抑制thrombin誘發的血小板凝集、細胞內鈣離子流動以及P-selectin的表現。除此之外，我們利用3-OMS和SB203580 (p38 MAPK抑制劑) 也能抑制thrombin刺激的IkB kinase (IKK)β?n和IκB?捘C酸化。為了進一步討論protease-activated receptors跟轉錄因子NF-?羠的關係，我們利用PAR1跟PAR4的活化劑來活化血小板凝集。由實驗結果得知，3-OMS能有效抑制PAR4活化劑引起的血小板凝集但卻不能抑制PAR1活化劑引起的血小板凝集。接著經由免疫沉澱法發現，在未經刺激的血小板中，neutral sphingomyelinase和PAR4是複合體，經由thrombin刺激以後，neutral sphingomyelinase會和PAR4分離，進而造成ceramide產生。另一方面，我們使用液相層析串聯式質譜儀發現血小板中的ceramide主要是以C24:0存在，且在凝血酶跟PAR4活化劑刺激之下，血小板中C24:0 ceramide的量會增加，但是在PAR1活化劑的刺激之下，C24:0 ceramide的量並不會有任何改變。除了以上的結果之外，我們外加C2-ceramide (ceramide相似物)發現C2-ceramide能造成血小板中IKKβ和p38 MAPK磷酸化。在活體實驗中得知，C2-ceramide能縮短凝血所需的時間。綜合以上的結果，在未經刺激的血小板中，neutral sphingomyelinase跟PAR4是複合物，經由thronbin刺激之後，neutral sphingomyelinase離開PAR4，造成ceramide的量增加，進而使p38 MAPK-NF-?羠活化，最後導致血小板凝集。
根據以上的結果，我們知道thrombin會造成血小板中ceramide的含量增加。過去的研究指出，ceramide活化的磷酸酯酶(Ceramide-activated protein phosphatases)，包括: protein phosphatase 1 (PP1)和protein phosphatase 2A (PP2A)。在血小板中，磷酸酯酶所扮演的角色目前尚未清楚。本研究中，我們發現okadaic acid (磷酸酯酶抑制劑)能促進thrombin誘導的血小板凝集。此外，thrombin也能增加PP2A的磷酸化，使得PP2A活性降低。藉由這樣的結果我們利用免疫沉法進一步發現，在未經刺激的血小板中，p38 MAPK和PP2A是複合體，經由thrombin刺激以後，p38 MAPK會和PP2A分離，造成p38 MAPK磷酸化。另一方面，thrombin卻減少Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1(SHP-1)的磷酸化。綜合以上結果，SHP-1跟PP2A可能共同調節p38 MAPK的活化，來平衡血小板中磷酸酯酶和去磷酸酯酶的相互作用