豬霍亂沙門氏菌Std線毛的分析及stdA基因在檢測沙門氏菌的應用

豬霍亂沙門氏菌 ( Salmonella enterica serovar Choleraesuis ) 具有宿主適應性，會造成豬隻副傷寒病症，另外，它會感染人類，並造成敗血症的發生。線毛（fimbriae）是一種位於大多數革蘭氏陰性菌外膜上的一種毛髮狀蛋白質結構物，豬霍亂沙門氏菌具有std線毛基因組，其可轉譯出相似於線毛的結構物。
本實驗室藉由PCR方式，增幅7.4 kb的std線毛基因組，將其選殖至pCR-XL-TOPO質體DNA，委外定序後，分析std線毛基因組之開放性讀框 ( ORF )，進而將此重組DNA送入大腸桿菌HB101，並藉由RT-PCR及西方點墨試驗觀察到S. Choleraesuis在靜置培養液中可以表現stdA線毛基因，進而有StdA蛋白質的產生，而震盪培養液及固態培養基均無法觀察到stdA線毛基因表現或是StdA蛋白質的產生。Std線毛的主要線毛次單位（major fimbrial subunit）為StdA，而其N端的胺基酸序列僅與沙門氏菌屬有同源性，在其他非沙門氏菌屬中則無同源性。因此若能以stdA當作偵測沙門氏菌的目標基因，在S. Choleraesuis之stdA基因上設計一對引子，藉由PCR方式，測試45種沙門氏菌血清型及15種非沙門氏菌菌株，用以做為偵測沙門氏菌的方法。在經PCR反應後，可觀察到這45種沙門氏菌血清型，共268株，均可產生518-bp大小的PCR產物，而15種非沙門氏菌菌株則無任何的PCR產物。而PCR的偵測敏感度為菌體DNA濃度3.4 × 10-1 pg，使用南方點墨試驗再次偵測，其敏感度提高為3.4 × 10-2 pg。並且進行接種試驗，屠體液中非沙門氏菌細菌數量為4 × 107 CFU/ml，當4.4 × 100 CFU/ml的沙門氏菌加上屠體液於培養液中增殖後，可以使用stdA成對引子藉由PCR方式看到stdA的產物，表示stdA成對引子在PCR反應液中存在沙門氏菌及其他菌種時，仍然可以順利進行反應，而不會受到影響。藉由這些實驗，我們了解到針對stdA所設計的成對引子確實具有專一性及高敏感度，能夠確實偵測出沙門氏菌。