探討抗α-異烯醇酶單株抗體抑制白色念珠菌之作用機制

白色念珠菌(Candida albicans)對人類是一種伺機性病原，喜愛酸性環境並常存於人體的口腔、皮膚、消化道、陰道等黏膜組織和臟器中。一般情況下，寄生於人體的念珠菌成酵母細胞型，不會引起疾病。但若宿主處在某些病理或生理因素影響下，導致免疫力降低時，白色念珠菌即大量繁殖成假菌絲型，侵犯人體組織，引起其他的併發症及造成高死亡率。近數十年來，患有免疫功能有缺陷病人族群如器官移植、血液腫瘤、愛滋病、接受免疫抑制劑或化學治療等病人的增加，C. albicans已是國內外院內感染最重要的致病菌之一。在美國，念珠菌菌屬為造成院內血液感染的第四名，也造成了49%的死亡率，在台灣更是蟬連四年(2011-2014) 院內感染菌種的第一名。烯醇酶(Enolase)，也被稱為磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)，大量存在於人體組織器官中，在糖化和發酵反應中都扮演了重要的角色。此外，Alpha-enolase (ENO1)在細胞表面上也會和plasminogen交互作用，加強tissure-plasminogen activator的表現和保護plasminogen不被α2-plasmin inhibitor抑制。 近年來累積的學術文件中也表明ENO1與病原菌感染宿主有關聯。可能機制為ENO1在許多病原體中扮演胞漿素原受器(plasminogen receptor) 的角色，並利用位於細胞表面的ENO1 蛋白去捕捉宿主的plasminogen，而病原體細胞表面的tissue plasminogen activator (tPA) 或urokinase plasminogen activator (uPA) 會將plasminogen活化成plasmin，進而降解宿主細胞胞外基質(Extracellular matrix, ECM)，幫助病原體侵入細胞並感染宿主。
在實驗室先前的研究中，用噬菌體展現技術成功篩選出對白色念珠菌的α-異烯醇酶(CaENO1) 具有特異性的單株抗體(CaS1 scFv)，並證實CaS1 scFv可降低CaENO1與plasminogen的結合力，進而減少C. albicans的感染力(Po-Yen Liao, unpublished data)。但CaS1 scFv與CaENO1之間，還有CaENO1與plasminogen之間的交互作用還不明瞭。本計畫運用不同的分子生物實驗進一步探討CaS1 scFv對CaENO1的結合能力，計算出CaS1 scFv的EC50 (KD)為1.88 × 10-8 M 。接著也經由實驗證實CaS1 scFv可以抑制C. albicans菌絲的生長。再來進行CaS1 scFv與 CaENO1結合的抗原決定位分析，找出抗原決定位為240KGKVGIAMDV249 和278PQLADLYEQLISEYP292。此外，我們也將CaENO1和plasminogen之間的結合區域範圍縮小至300AEDDWD-------VGLRSG437 (137個胺基酸)，並堆測CaS1 scFv在其中所扮演的角色。最後也成功將CaS1 scFv人源化(humanization) 並表現純化出hzCaS1 V1 and V3，實驗結果證實humanized CaS1 scFv保有對CaENO1的特異性結合能力。進而計算出hzCaS1 V1 and V3 scFv的EC50 (KD)分別為4.6 × 10-8 M 和8.4 × 10-8 M 。最後我們以matrix-gel degradation assay 證實CaS1、hzCaS1 V1 and V3 scFv確實可以抑制CaENO1和plasminogen的結合，並可能經由此路徑，降低C. albicans的感染能力。綜合以上結果顯示，此單株抗體有發展成為臨床抗體治療藥物和檢驗試劑的淺力。並當作日後進一步發展此單株抗體運用於對病原體檢測或標靶治療等臨床應用價值的參考。