急性肺損傷之研究：脂多醣對人類第二型肺泡上皮細胞凋亡影響及生合成表面張力蛋白基因調控之分子機轉研究

革蘭氏陰性細菌的外膜組成—脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)，是造成敗血病休克合併急性肺損傷的主要原因之一。人類第II型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial type II cells)為高度分化的細胞，會合成及分泌表面活性蛋白(surfactant proteins)，其作用為參與正常生理反應及敗血病引起的急性肺損傷之病理生理性調節。肺泡裡表面活性蛋白組成的改變在炎症期間是十分複雜的。類鐸受體(toll-like receptors, TLRs)在初始免疫系統中佔有相當重要的角色，它們可以傳遞病原體引發的訊息傳導並透過轉錄因子調控一些跟發炎有關的的特定基因表達活動。不同於低濃度LPS引起的生理活性，在老鼠氣管裡注入高濃度的LPS會直接引起支氣管的上皮細胞死亡。因此，LPS可能對人類第II型肺泡上皮細胞會導致病理生理及毒性影響。故本研究的目的是利用人類肺癌第II型類上皮A549細胞為實驗模組，探討LPS刺激後導致肺泡上皮細胞凋亡和表面活性蛋白生合成的分子機轉。
首先，研究分析毒性濃度LPS對人類第II型肺泡上皮細胞的細胞凋亡及其可能的分子機轉。將A549細胞用臨床濃度(1～10 ng/ml) LPS處理24小時並不會影該細胞的存活能力，而處理過毒性濃度(1～10μg/ml) LPS的A549細胞，其細胞存活能力呈現與濃度及時間效應有關的影響，A549細胞凋亡及壞死也呈現與濃度及時間效應有關的模式，但只有在10 μg/ml的濃度下細胞會有輕微的壞死現象。處理過毒性濃度LPS的A549細胞會增加細胞內一氧化氮(nitric oxide)及活性氧分子(reactive oxygen species)，用N-acetylcysteine前處理過A549細胞後，會降低細胞內一氧化氮及活性氧分子的產生，並可抑制凋亡的進行。另外毒性濃度LPS會讓A549細胞的粒線體膜電位及腺嘌呤核甘三磷酸(adenosine triphosphate)生合成減少，並誘發細胞色素c (cytochrome c)從粒線體釋放到細胞質中，而硫胱氨酸蛋白酶(caspase)-9及-6的活性被増強，且導致脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)碎片呈現時間效應有關的影響。再次用N-acetylcysteine前處理過A549細胞後，會改善caspase-9活性及減少DNA損害。
其次，我們研究評估臨床濃度LPS刺激A549細胞合成表面活性蛋白質的基因調控和它的可能分子傳遞機轉。將A549細胞用臨床濃度(1 ng/ml) LPS處理會造成表面活性蛋白A的蛋白質及訊息核糖核酸(message ribonucleic acid, mRNA)在濃度及時間效應上之增加；相反的，表面活性蛋白D的mRNA則不會被LPS刺激增加。接著將A549細胞用臨床濃度LPS處理後，可發現TLR2的mRNA也呈現時間效應的增加，及增加MEK4及JNK1蛋白質的磷酸化，同時會選擇性的增加c-Jun之核位移，但不影響c-Fos及NF-κB。於是將A549細胞植入TLR2的微小干擾訊息核糖核酸(small interference RNA, siRNA)處理後，會發現LPS反而降低A549細胞的TLR2蛋白質的製造，也同時使A549細胞產生表面活性蛋白A的蛋白質及mRNA減少，以及MEK4及JNK1蛋白質磷酸化的減少。然後用MyD88 siRNA處理A549細胞，發現MEK4蛋白質的磷酸化也降低。另外，前處理過SP600125(JNK1抑制劑)的A549細胞，會減少LPS刺激所產生c-Jun的核位移及表面活性蛋白A mRNA的基因表現。
總而言之，本實驗研究最終闡明了毒性濃度的LPS導致人類第II型肺泡上皮A549細胞凋亡是透過內因性的粒線體-cytochrome c-caspase的機轉進行，而臨床濃度的LPS刺激人類第II型肺泡上皮A549細胞生合成表面活性蛋白A的基因調控是透過TLR2誘導MyD88-MEK4-JNK1-AP-1的序列活化而進行。故LPS引起人類第II型肺泡上皮細胞凋亡及生合成表面活性蛋白A的基因調控，可說明了革蘭氏陰性菌感染會導致敗血性休克甚至急性肺損傷的臨床現象。本研究的缺憾是使用A549細胞，因為這些細胞是由肺腺癌衍生出來，畢竟與正常細胞在氧化反應、細胞凋亡及生合成表面活性蛋白應有所差異，故我們在未來將利用動物實驗透過轉譯研究來闡明LPS對肺泡上皮細胞的影響，並驗證我們現在的細胞株實驗結果。