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結核桿菌PONA1轉醣酶之純化與結晶
Other Title
Purification and Crystallization of Transglycosylase PONA1 from Mycobacterium tuberculosis
Type
thesis
Date Issued
2011-06-20
Author(s)
田薏雯
Advisor
林景堉
Subjects
系所名稱：醫學檢驗暨生物技術學系
Description
學位別：碩士
語文別：中文
指導教授：林景堉
共同指導教授：馬徹
口試委員：陳建仁;蘇家玉
中文關鍵字：結核桿菌PONA1;膜蛋白;轉醣酶蛋白質結晶
語文別：中文
指導教授：林景堉
共同指導教授：馬徹
口試委員：陳建仁;蘇家玉
中文關鍵字：結核桿菌PONA1;膜蛋白;轉醣酶蛋白質結晶
Abstract
結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起肺結核(tuberculosis)的主要致病菌。據世界衛生組織(World Health Organization；WHO)統計，全球約有三分之一的人口感染過結核桿菌，且每年約有一百萬人因肺結核而死亡。廣泛使用抗生素的結果導致結核桿菌抗藥性菌株的產生，而這在結核病的治療上是一項相當大的難題。
結核桿菌中有兩個大分子量的Class A青黴素結合蛋白(high molecular mass class A penicillin-binding proteins；HMM Class A PBPs)，分別為PONA1和PONA2。兩者皆為膜蛋白且同時具有轉胜肽酶 (transpeptidase；TP)與轉醣基酶(transglycosylase；TG)的酵素活性，這些酵素在細菌細胞壁胜肽聚醣(peptidoglycan)的合成上扮演著很重要的角色。因此，能夠抑制這兩種活性的藥物，理論上能夠有效對抗結核桿菌。但目前臨床上用於治療肺結核的第一線與第二線抗生素並沒有以此兩種酵素活性作為標的。為此，結核桿菌HMM Class A PBPs的結構，在未來肺結核藥物設計上是一項極具價值的研究。
本篇論文研究中，結核桿菌H37Rv株PONA1膜蛋白及其不同長度的片段以大腸桿菌(E. coli)為表現系統並利用介面活性劑進行膜蛋白萃取，將萃取出來的蛋白質以鎳離子螯合樹脂(Ni-NTA resin)純化，粗純化的蛋白質進一步以尺寸排除層析法(size exclusive chromatography)分離單元體及二元體。此外，同一製程的蛋白質同時利用NBD-Lipid II進行TG活性測試與利用SPR測量蛋白與moenomycin的結合能力，以確保結晶的蛋白具備活性。實驗中，我們嘗試了各種不同的介面活性劑，進行結晶條件的測試，以期取得moenomycin 與蛋白結合的晶體，做為將來藥物開發的依據。
結核桿菌中有兩個大分子量的Class A青黴素結合蛋白(high molecular mass class A penicillin-binding proteins；HMM Class A PBPs)，分別為PONA1和PONA2。兩者皆為膜蛋白且同時具有轉胜肽酶 (transpeptidase；TP)與轉醣基酶(transglycosylase；TG)的酵素活性，這些酵素在細菌細胞壁胜肽聚醣(peptidoglycan)的合成上扮演著很重要的角色。因此，能夠抑制這兩種活性的藥物，理論上能夠有效對抗結核桿菌。但目前臨床上用於治療肺結核的第一線與第二線抗生素並沒有以此兩種酵素活性作為標的。為此，結核桿菌HMM Class A PBPs的結構，在未來肺結核藥物設計上是一項極具價值的研究。
本篇論文研究中，結核桿菌H37Rv株PONA1膜蛋白及其不同長度的片段以大腸桿菌(E. coli)為表現系統並利用介面活性劑進行膜蛋白萃取，將萃取出來的蛋白質以鎳離子螯合樹脂(Ni-NTA resin)純化，粗純化的蛋白質進一步以尺寸排除層析法(size exclusive chromatography)分離單元體及二元體。此外，同一製程的蛋白質同時利用NBD-Lipid II進行TG活性測試與利用SPR測量蛋白與moenomycin的結合能力，以確保結晶的蛋白具備活性。實驗中，我們嘗試了各種不同的介面活性劑，進行結晶條件的測試，以期取得moenomycin 與蛋白結合的晶體，做為將來藥物開發的依據。