磁性冷凍對牙髓解剖構造和機械特性之影響

隨著牙醫學的進步，牙齒疾患的處理趨向保守性地保留牙齒，同時修復與再生成為牙醫領域愈發重視的課題。近年來，冷凍醫學的發展愈發成熟，利用玻璃化冷凍技術來完整保存細胞組織的活性已漸廣泛應用。由於牙齒組織中富含間質幹細胞 (mesenchymal stem cell, MSC)，擁有自我更新與多元分化能力，具再生醫療應用價值，所以牙齒與相關組織的保存實具學術與臨床雙重重要意義。臨床上，智齒或因齒顎矯正需求而拔除的小臼齒等，往往成為醫療廢棄物，若能突破冷凍技術門檻而將牙齒完好保存，不僅能廢物利用而於未來解凍後再植 (autotransplantation)，也有機會利用富含MSC的牙髓組織，成為組織再生工程元素。本研究比較牙齒拔下後，於不同時間點，在冷凍過程中分別利用新式磁性冷凍法以及 -200C傳統冷凍法來保存整顆老鼠門齒及人類小臼齒，而以另一側未冷凍之牙齒為對照組。牙齒的選擇，為28天齡健康大公鼠的上下門齒，其冷凍時間點為拔下後0、12、24小時；而人類則為10-35歲健康無病變且因齒顎矯正所需而拔除的小臼齒，其冷凍時間點則為0及24小時。解凍且經脫鈣處理後，將牙髓組織進行切片並以HE染色觀察，比較牙髓之解剖構造變化，同時在光學顯微鏡下計算牙本質母細胞 (odontoblast)，及富含細胞層 (cell rich zone) 細胞數目的差異，另外藉由拉力測試機來分別測量牙髓組織的楊氏模數，以瞭解冷凍對牙髓結構的影響，利用t-test及 Two-Way ANOVA 作統計。結果顯示，不同冷凍法間所呈現的牙髓解剖形態變化差異不大，但在細胞數量變化上，不同冷凍法間卻有明顯不同。老鼠門齒拔下後立即處理比較，牙髓之單位面積牙本質母細胞數在不冷凍組、磁性冷凍組、傳統冷凍組分別為：130.4 ± 6.8 cells/mm2、93.1 ± 16.0 cells/mm2、74.5 ± 7.9 cells/mm2 (p＜0.05 )；而富含細胞層之單位面積細胞數分別為 95.2 ± 16.4 cells/mm2、74.7 ± 18.8 cells/mm2、63.7 ± 16.0 cells/mm2 (p＜0.05)。在門齒拔下後12小時後實驗部分，牙本質母細胞數在不冷凍組、磁性冷凍組、傳統冷凍組分別為：86.9 ± 0 cells/mm2、71.0 ± 13.8 cells/mm2、68.3 ± 6.8 cells/mm2；而富含細胞層之單位面積細胞數分別為：75.9 ± 15.0 cells/mm2、 54.8 ± 15.9 cells/mm2、47.4 ± 13.0 cells/mm2 ( p＜0.05 )。在門齒拔下後24小時後實驗部分，牙本質母細胞數在不冷凍組、磁性冷凍組、傳統冷凍組分別為：70.4 ± 6.4 cells/mm2、68.3 ± 21.5 cells/mm2、66.2 ± 7.2 cells/mm2；而富含細胞層之單位面積細胞數分別為：59.6 ± 13.4 cells/mm2、52.3 ± 19.4 cells/mm2、39.9 ± 12.0 cells/mm2。上述結果均顯示，牙本質母細胞數及富含細胞層細胞數，都是不冷凍多於磁性冷凍，而前兩者則均多於傳統冷凍；在時間方面，則是0小時多於12小時，而前兩者均多於24小時。經由二因子變異數分析 (Two-Way ANOVA)，亦呈現不同冷凍方法、不同時間冷凍都有顯著差異。在人類小臼齒部份，將冷凍實驗組除以不冷凍對照組之標準化數據進行比較：牙齒拔下後立刻實驗，牙本質母細胞數之實驗組/對照組比值在磁性冷凍部分為0.97，傳統冷凍法為0.59 ± 0.32；富含細胞層部分，磁性冷凍與傳統冷凍法比值分別為0.88及0.67 ± 0.30。在牙齒拔下後24小時實驗上，牙本質母細胞數部分，磁性冷凍組為0.96 ± 0.02，傳統冷凍組為0.57 ± 0.17 ( p＜0.05 )；而在富含細胞層部分，磁性冷凍與傳統冷凍比值分別為0.82 ± 0.14與 0.45 ± 0.01 (p＜0.05 )。在力學性質部分，人類小臼齒牙髓經拉力測試機實驗所計算出的楊氏模數，牙齒拔下0小時實驗組部分：不冷凍組為 3.1 ± 1.7 MPa，磁性冷凍組為 3.6 ± 1.9 MPa，傳統冷凍組為 3.4 ± 1.7 MPa，三組並無顯著差異。而牙齒在拔下後放在00C~40C的運送液中，經過24小時後實驗部分：不冷凍組為 3.3 ± 1.0 MPa，磁性冷凍組為 3.5 ± 1.5 MPa，傳統冷凍組為 4.7 ± 1.9 MPa，亦無顯著差異。本研究結果顯示，磁性冷凍與傳統冷凍法，對牙髓支持結構的影響並無顯著差異，亦即牙髓在硬組織的保護下經冷凍及解凍，其機械性質仍能被保護住。但細胞數的差異則顯示，磁性冷凍可以獲得較傳統冷凍更好的組織保存效益。